ELISA酶聯(lián)免疫吸附
酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面,使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測(cè)大分子抗原和特異性抗體等,具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。
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實(shí)驗(yàn)介紹
【實(shí)驗(yàn)原理】
它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接,然后通過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng),用于定量測(cè)定。測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。
在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑:
①固相的抗原或抗體(免疫吸附劑);②酶標(biāo)記的抗原或抗體(標(biāo)記物);③酶作用的底物(顯色劑)。
測(cè)量時(shí),抗原(抗體)先結(jié)合在固相載體上,但仍保留其免疫活性,然后加一種抗體(抗原)與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物(標(biāo)記物),此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性,當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原(抗體)反應(yīng)結(jié)合后,再加上酶的相應(yīng)底物,即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。其所生成的顏色深淺與欲測(cè)的抗原(抗體)含量成正比。 這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察,也可以用分光光度計(jì)(酶標(biāo)儀)加以測(cè)定。其方法簡(jiǎn)單,方便迅速,特異性強(qiáng)。
【實(shí)驗(yàn)方法】
Step1: 加待測(cè)樣,溫育、洗滌
Step2: 加酶標(biāo)抗體,溫育、洗滌
Step3: 加底物,溫育顯色
Step4: 加終止液
Step5: 讀數(shù)
案例展示
ELISA檢測(cè)2組樣本中bFGF蛋白含量
技術(shù)總結(jié)
加樣本和反應(yīng)試劑時(shí)必須注意避免以下幾點(diǎn):
1、加樣太快,無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。需勻速加樣,吸樣時(shí),加樣槍需按到第一檔,加樣時(shí),加樣槍需直接按到底;
2、加樣應(yīng)直接加入反應(yīng)孔底部,加在反應(yīng)孔壁上易濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染。盡量避免出現(xiàn)氣泡;
3、反應(yīng)試劑的加入時(shí)先要注意試劑的有效期,再注意滴加的角度和滴加速度。滴加太快易出現(xiàn)重復(fù)滴加在兩孔之間。
送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)
樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運(yùn)輸條件 | 備注 |
---|---|---|---|---|
動(dòng)物組織 | 單個(gè)樣品>0.1g,2mlEP管或凍存管裝,不要過(guò)量;樣本應(yīng)盡量新鮮,如不能立即提取蛋白或核酸,應(yīng)液氮速凍后凍存于-80℃或更低,凍存樣本避免反復(fù)凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記,且標(biāo)記清晰可識(shí) |
種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本,單個(gè)樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
貼壁/懸浮細(xì)胞 | 1. 總RNA或蛋白:106cell/指標(biāo)、漿/核RNA或蛋白:107cell/指標(biāo)、線粒體RNA或蛋白:2*107 cell/指標(biāo),樣本盡量新鮮,細(xì)胞收取后直接加Trizol(QPCR檢測(cè))或直接凍存于-80℃ 2. 若細(xì)胞處理(加藥、轉(zhuǎn)染、感染)后狀態(tài)差應(yīng)酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml,骨髓 1~3ml; -80℃保存不超半周的白細(xì)胞勻漿>400μl,每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
石蠟包埋樣品 | 由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊,有效厚度大于 0.1cm; 新鮮的 FFPE 組織切片,每片厚度不超過(guò) 10μm,2~8 張,表面積不超過(guò) 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿足相應(yīng)實(shí)驗(yàn)要求的抗體; 2. 按抗體說(shuō)明書(shū)要求寄送,盡量避免分裝;如分裝,確保量足夠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),并提供抗體說(shuō)明書(shū)。 3.保存抗體的抗體管上應(yīng)有能夠識(shí)別此抗體的標(biāo)記,抗體的量應(yīng)大于實(shí)驗(yàn)所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
引物 | 干粉,≥1OD,如進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),每個(gè)基因至少提供兩對(duì)引物, 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |