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實驗介紹
【應用簡介】
凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細胞稱之為原代細胞。通過原代分離獲得的細胞具有與體內(nèi)細胞相似的生物學特征，是研究生物體相關生命活動的理想材料。
【原理介紹】
原代細胞的分離是將人/小鼠等特異模式動物的細胞從機體中取出，經(jīng)胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖的過程。 原代培養(yǎng)是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進行培養(yǎng)。因此，較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時的細胞保持原有細胞的基本性質(zhì)，如果是正常細胞，仍然保留二倍體數(shù)。但實際上，通常把第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。最常用的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細胞培養(yǎng) 。
【實驗方法】
一、懸浮細胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用低速離心。經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細胞。
二、實體組織材料的分離方法
對于實體組織材料，由于細胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機械分散法的特點是簡便、快速，但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團塊（或糊狀），應用酶的生化作用和非酶的化學作用進一步使細胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大量單個細胞的細胞懸液，接種培養(yǎng)后，細胞容易貼壁生長。
三、小鼠肝細胞原代培養(yǎng)
1、取肝臟：將小鼠斷頸致死，取肝臟；
2、除雜物：剔除脂肪、結(jié)締組織、血液等雜物；
3、研磨肝臟：用手術(shù)剪將臟器剪成小塊并研磨；
4、胰酶消化：加入胰酶消化，使細胞分離；
5、濾網(wǎng)去雜：用濾網(wǎng)過濾，除去大組織塊；
6、細胞計數(shù)：血球計數(shù)板計數(shù)。
案例展示
原代分離后的鏡下白光圖片
技術(shù)總結(jié)
原代培養(yǎng)注意事項
（1）原代培養(yǎng)材料的選擇，盡量選取繁殖能力較強的組織，如胚胎、幼小的生物體或者腫瘤組織等。
（2）要注意無菌操作。其操作要求應高于外科手術(shù)、
（3）整個取材操作要迅速，尤其孕鼠浸泡乙醇時間1min左右，不能過長，以確保胚胎細胞活性。
（4）運用消化法時胰酶溫度應低于37℃，濃度只需平時消化細胞濃度的一半。因為此過程不像消化培養(yǎng)細胞時的1~10min，而是至少20min，先消化下來的細胞在此胰酶消化液中繼續(xù)消化了10min以上。所以胰酶不能作用過強，否則這些細胞易被損傷而不易生存。
（5）如使用組織塊法，則應待組織塊略干燥，能黏附于瓶壁時再使之與培養(yǎng)液接觸，匆使組織塊漂浮起來。如果組織塊沒有黏壁，則細胞不易生長，即使生長也因沒有貼在瓶壁上，從而因不能觀察到而無法收集到生長的細胞。
（6）原代培養(yǎng)操作時，也可以使用未添加血清的DMEM或PBS洗滌子宮、胚胎或組織塊等。
（7）本實驗也可以使用新生乳鼠做培養(yǎng)材料。此時要將乳鼠浸入75%乙醇2~3min使皮膚充分消毒，由于乳鼠原代培養(yǎng)污染概率更高，故應小心操作，避免污染細菌。乳鼠原代培養(yǎng)細胞的存活率不及胚胎細胞培養(yǎng)的成功率。
送樣與交付標準
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 凍存細胞 | 1.取對數(shù)生長期的細胞，消化離心收集細胞，加入凍存液吹打混勻，裝入凍存管，標明細胞名稱/細胞代數(shù)，凍存細胞數(shù)量在1-5*106個/ml。 2.項目啟動后細胞復蘇，復蘇后3天反饋細胞狀態(tài)，3-5天反饋細胞污染情況，5-7天反饋支原體污染情況。 3. 細胞詳細信息（名稱、培養(yǎng)基和其他培養(yǎng)條件等，如經(jīng)過特別處理需告知并提供必要的信息） | 液氮 | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標記，且標記清晰可識 |
| 復蘇后細胞 | 1.使用T25培養(yǎng)瓶運輸。細胞匯合度達到60%以上，裝滿培養(yǎng)液，只留紐扣大小的氣泡，瓶口用封口膜封好，標明細胞名稱/細胞代數(shù)/接種時間/培養(yǎng)基類型，瓶子固定運輸。 2.收到細胞后3天反饋細胞狀態(tài)，3-5天反饋細胞污染情況，5-7天反饋支原體污染情況。 3. 細胞詳細信息（名稱、培養(yǎng)基和其他培養(yǎng)條件等，如經(jīng)過特別處理需告知并提供必要的信息） | 常溫 | 常溫 | |
| 質(zhì)粒 | 1.純度高，無內(nèi)毒素，無蛋白質(zhì)，基因組DNA/RNA污染，質(zhì)粒A260:A280的比值在1.8-2.0之間 2.濃度不低于0.5μg/μl，總量大于100μg，無內(nèi)毒素處理 3. 載體詳細信息，包括名稱、大小、抗性、熒光標記 | -20℃ | 冰袋 | |
| 病毒 | 1.慢病毒：滴度不低于1*108TU/ml，體積約200μl，標明制備時間，且沒有反復凍融 2.腺病毒：滴度不低于1*109PFU/ml，體積約200μl，標明制備時間，且沒有反復凍融 3.明確是否表達熒光標簽蛋白及其種類，最好需要提供病毒載體圖譜； | -80℃ | 干冰 |
電話：400-691-6686
在線時間：8:00-24:00
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