慢病毒包裝
慢病毒包裝主要應(yīng)用于以下幾個(gè)方面： 1、對于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而且目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加，極大地方便了RNAi，cDNA克隆以及報(bào)告基因的研究； 2、進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選； 3、為活體動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液。
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實(shí)驗(yàn)介紹
【應(yīng)用簡介】
在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，對于按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚至無法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，通過使用病毒介導(dǎo)的方式能夠大大提高基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，達(dá)到目的基因高效表達(dá)的目的。
具體來說，慢病毒包裝主要應(yīng)用于以下幾個(gè)方面：
1、對于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而且目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加，極大地方便了RNAi，cDNA克隆以及報(bào)告基因的研究；
2、進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選；
3、為活體動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液。
【技術(shù)原理】
慢病毒表達(dá)載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)粒可提供所有的轉(zhuǎn)錄、包裝、重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝。包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。離心收集上清液后，可以直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。
【實(shí)驗(yàn)方法】
1、細(xì)胞準(zhǔn)備：細(xì)胞傳到后，密度達(dá)到70％左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；
2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取兩個(gè)EP管，一個(gè)加入Opti-MEM、核心質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒；另一個(gè)加入Opti-MEM、lipo2000，然后將兩管混勻；
3、細(xì)胞孵育：將混合液逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，混勻后孵育；
4、收集病毒：轉(zhuǎn)染后48h、72h收集含慢病毒的上清；
5、滴度檢測：細(xì)胞為30%－50％時(shí)加入病毒上清液，檢測陽性細(xì)胞比例。
案例展示
慢病毒感染的細(xì)胞（左：白光；右：熒光）
技術(shù)總結(jié)
1、獲取的目的基因一定要精確（注：客戶提供基因ID）；
2、針對目的基因設(shè)計(jì)合成shRNA建議設(shè)計(jì)3對，以保證效果，節(jié)省實(shí)驗(yàn)周期；
3、要選擇符合要求的載體；
4、構(gòu)建的過慢病毒載體需要經(jīng)過測序驗(yàn)證；
5、對于測序正確的重組質(zhì)粒，需要提取和純化高質(zhì)量的不含內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒；
6、使用高效重組載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行病毒包裝并收集上清液；
7、通過超濾和超速離心濃縮和純化病毒；
8、建議病毒使用前先測定病毒滴度。
送樣與交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運(yùn)輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 凍存細(xì)胞 | 1.取對數(shù)生長期的細(xì)胞，消化離心收集細(xì)胞，加入凍存液吹打混勻，裝入凍存管，標(biāo)明細(xì)胞名稱/細(xì)胞代數(shù)，凍存細(xì)胞數(shù)量在1-5*106個(gè)/ml。 2.項(xiàng)目啟動(dòng)后細(xì)胞復(fù)蘇，復(fù)蘇后3天反饋細(xì)胞狀態(tài)，3-5天反饋細(xì)胞污染情況，5-7天反饋支原體污染情況。 3. 細(xì)胞詳細(xì)信息（名稱、培養(yǎng)基和其他培養(yǎng)條件等，如經(jīng)過特別處理需告知并提供必要的信息） | 液氮 | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識(shí) |
| 復(fù)蘇后細(xì)胞 | 1.使用T25培養(yǎng)瓶運(yùn)輸。細(xì)胞匯合度達(dá)到60%以上，裝滿培養(yǎng)液，只留紐扣大小的氣泡，瓶口用封口膜封好，標(biāo)明細(xì)胞名稱/細(xì)胞代數(shù)/接種時(shí)間/培養(yǎng)基類型，瓶子固定運(yùn)輸。 2.收到細(xì)胞后3天反饋細(xì)胞狀態(tài)，3-5天反饋細(xì)胞污染情況，5-7天反饋支原體污染情況。 3. 細(xì)胞詳細(xì)信息（名稱、培養(yǎng)基和其他培養(yǎng)條件等，如經(jīng)過特別處理需告知并提供必要的信息） | 常溫 | 常溫 | |
| 質(zhì)粒 | 1.純度高，無內(nèi)毒素，無蛋白質(zhì)，基因組DNA/RNA污染，質(zhì)粒A260:A280的比值在1.8-2.0之間 2.濃度不低于0.5μg/μl，總量大于100μg，無內(nèi)毒素處理 3. 載體詳細(xì)信息，包括名稱、大小、抗性、熒光標(biāo)記 | -20℃ | 冰袋 | |
| 病毒 | 1.慢病毒：滴度不低于1*108TU/ml，體積約200μl，標(biāo)明制備時(shí)間，且沒有反復(fù)凍融 2.腺病毒：滴度不低于1*109PFU/ml，體積約200μl，標(biāo)明制備時(shí)間，且沒有反復(fù)凍融 3.明確是否表達(dá)熒光標(biāo)簽蛋白及其種類，最好需要提供病毒載體圖譜； | -80℃ | 干冰 |
交付標(biāo)準(zhǔn)：
滴度:>108TU/ml
規(guī)格:1ml
贈(zèng)送陰性對照病毒規(guī)格:0.2ml（>108TU/ml）
電話：400-691-6686
在線時(shí)間：8:00-24:00
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