穩(wěn)定表達細胞系構(gòu)建
將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上，載體被轉(zhuǎn)染到宿主細胞并整合到宿主染色體中，用載體中所含的抗性標(biāo)志進行篩選。最常用的真核表達載體的抗性篩選標(biāo)志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，篩選得到可穩(wěn)定表達目的蛋白，或者穩(wěn)定表達沉默特定基因的細胞株。
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穩(wěn)定表達細胞系構(gòu)建
【應(yīng)用簡介】
穩(wěn)轉(zhuǎn)株主要應(yīng)用于以下研究中：
1、需要長期在目的細胞中研究基因功能。通過構(gòu)建穩(wěn)定株，可以大大降低頻繁轉(zhuǎn)染或者病毒包裝的成本，也方便長期的實驗研究；
2、部分蛋白半衰期及長，瞬時RNA只能干擾表達，無法去除已經(jīng)表達的目的蛋白，通過構(gòu)建穩(wěn)定株可以實驗更好的基因干擾效果；
3、瞬轉(zhuǎn)會引入不可預(yù)期的拷貝數(shù)表達（往往瞬時表達較高），導(dǎo)致因為人為因素造成實驗結(jié)果的不精確，構(gòu)建穩(wěn)定株可以幫助篩選到拷貝數(shù)適量的細胞進行實驗研究；
4、穩(wěn)轉(zhuǎn)株可以用于誘導(dǎo)表達系統(tǒng)的實驗，用于控制基因的時空表達；
5、需要用目的細胞構(gòu)建動物模型的實驗，往往需要構(gòu)建成穩(wěn)定株。
【原理介紹】
將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上，載體被轉(zhuǎn)染到宿主細胞并整合到宿主染色體中，用載體中所含的抗性標(biāo)志進行篩選。最常用的真核表達載體的抗性篩選標(biāo)志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，篩選得到可穩(wěn)定表達目的蛋白，或者穩(wěn)定表達沉默特定基因的細胞株。
慢病毒幾乎可以感染所有種類的細胞，并且在感染后可以整合到受感染細胞的基因組，進行長時間的穩(wěn)定表達，因此，慢病毒常用于制備穩(wěn)定表達/沉默特定基因的單克隆細胞株。
【實驗方法】
1、目的細胞的合適抗生素濃度篩選；
2、目的細胞的合適病毒滴度篩選；
3、慢病毒構(gòu)建與包裝與滴度測定；
4、慢病毒感染；
5、特定抗生素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株；
6、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株鑒定。
案例展示
Hela細胞多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株
多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株的熒光通常強弱夾雜，從感染72小時后開始加入篩選藥物，每隔2天重新?lián)Q液加入篩選藥物。藥物篩選需至少持續(xù)14天，直至顯微鏡下觀察到的熒光細胞比例為100%。
技術(shù)總結(jié)
穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建是一個長時間多平臺合作的項目，有多種因素容易導(dǎo)致穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建失?。?/strong>
1、支原體污染問題
細胞支原體輕度的污染不會影響細胞的增殖和生長，但是在病毒感染后容易大規(guī)模爆發(fā)，進而導(dǎo)致穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建失??；
2、慢病毒保存不當(dāng)
3、慢病毒制備好后需及時分裝并放置于-80℃保存，避免反復(fù)凍融；
4、目的基因表達水平低
5、細胞感染病毒后毒性大導(dǎo)致細胞死亡。
送樣與交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 凍存細胞 | 1.取對數(shù)生長期的細胞，消化離心收集細胞，加入凍存液吹打混勻，裝入凍存管，標(biāo)明細胞名稱/細胞代數(shù)，凍存細胞數(shù)量在1-5*106個/ml。 2.項目啟動后細胞復(fù)蘇，復(fù)蘇后3天反饋細胞狀態(tài)，3-5天反饋細胞污染情況，5-7天反饋支原體污染情況。 3. 細胞詳細信息（名稱、培養(yǎng)基和其他培養(yǎng)條件等，如經(jīng)過特別處理需告知并提供必要的信息） | 液氮 | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識 |
| 復(fù)蘇后細胞 | 1.使用T25培養(yǎng)瓶運輸。細胞匯合度達到60%以上，裝滿培養(yǎng)液，只留紐扣大小的氣泡，瓶口用封口膜封好，標(biāo)明細胞名稱/細胞代數(shù)/接種時間/培養(yǎng)基類型，瓶子固定運輸。 2.收到細胞后3天反饋細胞狀態(tài)，3-5天反饋細胞污染情況，5-7天反饋支原體污染情況。 3. 細胞詳細信息（名稱、培養(yǎng)基和其他培養(yǎng)條件等，如經(jīng)過特別處理需告知并提供必要的信息） | 常溫 | 常溫 | |
| 質(zhì)粒 | 1.純度高，無內(nèi)毒素，無蛋白質(zhì)，基因組DNA/RNA污染，質(zhì)粒A260:A280的比值在1.8-2.0之間 2.濃度不低于0.5μg/μl，總量大于100μg，無內(nèi)毒素處理 3. 載體詳細信息，包括名稱、大小、抗性、熒光標(biāo)記 | -20℃ | 冰袋 | |
| 病毒 | 1.慢病毒：滴度不低于1*108TU/ml，體積約200μl，標(biāo)明制備時間，且沒有反復(fù)凍融 2.腺病毒：滴度不低于1*109PFU/ml，體積約200μl，標(biāo)明制備時間，且沒有反復(fù)凍融 3.明確是否表達熒光標(biāo)簽蛋白及其種類，最好需要提供病毒載體圖譜； | -80℃ | 干冰 |
電話：400-691-6686
在線時間：8:00-24:00
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