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實驗介紹
【實驗介紹】
Co-IP主要用于檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用，是IP實驗的一種擴展， 基于IP反應的潛力，在樣品溶液中捕獲和純化主要目標（抗原等）及通過天然相互作用靶標結合的其他的大分子。此外，還可以利用Co-IP來確定在不同條件下的蛋白質(zhì)相互作用。
CO-IP的應用場景主要是：
1、用于研究蛋白質(zhì)復合體成分（通過IP級抗體直接捕獲目的蛋白族群，或通過構建帶標簽的目的蛋白融合表達載體并通過標簽蛋白的IP抗體進行免疫捕獲。常與western blot和蛋白質(zhì)譜聯(lián)用進行IP產(chǎn)物分析）。
2、用于檢測生理狀態(tài)下存在的蛋白質(zhì)互作關系。
3、 用于檢測蛋白質(zhì)的修飾狀態(tài)，如泛素化。
【技術原理】
免疫共沉淀是利用抗原和抗體的特異性結合以及細菌的Protein G或A能特異性地結合到免疫球蛋白的Fc片段的方法。其基本原理是在細胞裂解液中加入感興趣蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體特異結合的結合于磁珠的Protein G或A，若細胞中存在與興趣蛋白相結合的目的蛋白，就可以形成蛋白復合物：“目的蛋白—興趣蛋白—抗興趣蛋白抗體—Protein G或A”；最后通過免疫印跡實驗來檢測目的蛋白。
【實驗流程】
案例展示
技術總結
【技術總結】
1、實驗樣品制備方法準備：很重要！根據(jù)研究目的，檢測樣品可能是組織樣品，也可能是細胞樣品，不同樣品制備流程不太相同，目的蛋白表達量也有較大差別，必須選擇合適的樣品和樣品制備方法。
2、根據(jù)研究目的選擇適合的蛋白特異性抗體：非常重要！用于Co-IP實驗的抗體是針對目的蛋白的特異性抗體，最理想的是選擇一種能識別興趣蛋白質(zhì)某個表位的抗體，且這個表位不會被任何其他蛋白質(zhì)相互作用所掩蓋，比普通WB抗體要求高出很多；同時，抗體特異性和靈敏性盡可能高，才有可能有干凈的背景和較好的IP效果，所以必須選擇最適合的抗體用于Co-IP實驗。
【注意事項】
1、細胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP-40 或 Triton- X-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗確定；
2、不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細胞裂解液中要加各種酶抑制劑；
3、使用對照抗體：單克隆抗體：正常小鼠的 IgG 或另一類單抗;兔多克隆抗體：正常兔 IgG；
4、確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生；
5、要確?？贵w的特異性，即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀；
6、確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細胞中，而不是由于細胞的溶解才發(fā)生的，這需要進行蛋白質(zhì)的定位來確定。
送檢與交付標準
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 動物組織 | 單個樣品>0.1g，2mlEP管或凍存管裝，不要過量；樣本應盡量新鮮，如不能立即提取蛋白或核酸，應液氮速凍后凍存于-80℃或更低，凍存樣本避免反復凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標記，且標記清晰可識 |
| 種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本，單個樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 貼壁/懸浮細胞 | 1. 總RNA或蛋白：106cell/指標、漿/核RNA或蛋白：107cell/指標、線粒體RNA或蛋白：2*107 cell/指標，樣本盡量新鮮，細胞收取后直接加Trizol（QPCR檢測）或直接凍存于-80℃ 2. 若細胞處理（加藥、轉染、感染）后狀態(tài)差應酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白細胞勻漿>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蠟包埋樣品 | 由標準的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊，有效厚度大于 0.1cm； 新鮮的 FFPE 組織切片，每片厚度不超過 10μm，2~8 張，表面積不超過 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿足相應實驗要求的抗體； 2. 按抗體說明書要求寄送，盡量避免分裝；如分裝，確保量足夠進行實驗，并提供抗體說明書。 3.保存抗體的抗體管上應有能夠識別此抗體的標記，抗體的量應大于實驗所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如進行預實驗，每個基因至少提供兩對引物， 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |
電話：400-691-6686
在線時間：8:00-24:00
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