基因表達(dá)調(diào)控及相關(guān)元件介紹及下載

高中階段我們學(xué)過(guò)中心法則，中心法則是指遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再?gòu)腞NA傳遞給蛋白質(zhì)，即完成遺傳信息的傳遞過(guò)程。生物體的絕大部分生命活動(dòng)都遵循該法則。中心法則主要是圍繞DNA，RNA，蛋白質(zhì)來(lái)展開，通過(guò)這個(gè)過(guò)程實(shí)現(xiàn)遺傳信息的表達(dá)與傳遞。
那三個(gè)生物大分子之間是如果進(jìn)行遺傳信息的傳遞的呢？首先，遺傳信息儲(chǔ)存在DNA中，通過(guò)轉(zhuǎn)錄將遺傳信息轉(zhuǎn)移到mRNA中，mRNA中含有密碼子，一個(gè)密碼子決定一個(gè)氨基酸，氨基酸最終組成蛋 白質(zhì)，這個(gè)過(guò)程也就是蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程。除了mRNA 以外，RNA還包括rRNA（它與蛋白質(zhì)結(jié)合而形成核糖體，其功能是在mRNA的指導(dǎo)下將氨基酸合成為肽鏈），tRNA（tRNA能根據(jù)mRNA的遺傳密碼依次準(zhǔn)確地將它攜帶的氨基酸連結(jié)起來(lái)形成多肽鏈）。

圖一 中心法則

    今天我們以前來(lái)回顧一下真核生物基因表達(dá)的過(guò)程，這個(gè)過(guò)程涉及許多的名詞，在平時(shí)的科研生活中，很多同學(xué)對(duì)這些名詞也都很困惑，今天咱們就系統(tǒng)性的來(lái)復(fù)盤一下。

首先我們看一下基因的結(jié)構(gòu)：基因是染色體上具有控制生物性狀的DNA片段?；蛟诮Y(jié)構(gòu)上可分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)，且非編碼區(qū)多于編碼區(qū)。在非編碼區(qū)，存在著許多的元件，它們雖不直接參與基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，但也對(duì)基因的表達(dá)起這重要的作用。

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圖二 基因結(jié)構(gòu)及作用元件

增強(qiáng)子是存在于DNA上的一段可以與蛋白質(zhì)結(jié)合的區(qū)段，增強(qiáng)子通過(guò)影響DNA的結(jié)構(gòu)和功能，結(jié)合特定的轉(zhuǎn)錄因子和輔因子，從而激活或增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)真核基因的時(shí)空表達(dá)起著重要的調(diào)控作用。

    啟動(dòng)子的主要作用是啟動(dòng)和調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子可以活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確地結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特性。它能夠指導(dǎo)全酶同模板正確結(jié)合，活化RNA聚合酶，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子區(qū)一般包含兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別是CAAT Box（控制轉(zhuǎn)錄起始的頻率）和TATA Box（使轉(zhuǎn)錄精確地起始）。

    終止子是位于基因末端，給RNA聚合酶提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列。

    沉默子：沉默子是一段能夠結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的DNA序列，這種轉(zhuǎn)錄因子稱為阻遏蛋白。與增強(qiáng)子對(duì)DNA轉(zhuǎn)錄的加強(qiáng)作用相反，沉默子會(huì)抑制DNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。

    非編碼區(qū)的這些元件統(tǒng)稱為順式作用元件包括啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，沉默子等，可與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。

    說(shuō)完了非編碼區(qū)，我們?cè)賮?lái)看看編碼區(qū)。編碼區(qū)主要由內(nèi)含子和外顯子組成，真核生物絕大部分是斷裂基因，內(nèi)含子和外顯子交替排布。

    外顯子是斷裂基因中的編碼序列，在后續(xù)mRNA的加工過(guò)程中被保存，是能編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列。

    內(nèi)含子是基因中無(wú)編碼功能的序列，也存在于pre-RNA中。

那么基因又是怎么成為直接參與生物體生命活動(dòng)的蛋白質(zhì)的呢？這就涉及到基因的表達(dá)，今天我們主要講一下基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯這兩個(gè)過(guò)程。

    轉(zhuǎn)錄：是以DNA為模板，以4種NTP為原料，依據(jù)堿基配對(duì)規(guī)律，在DNA 指導(dǎo)（或依賴 DNA）的 RNA聚合酶催化下合成RNA的過(guò)程。真核生物的轉(zhuǎn)錄涉及許多的酶類以及蛋白因子，其中最重要的是轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶。

    轉(zhuǎn)錄因子（Transcription Factors, TFs）指能夠以序列特異性方式結(jié)合DNA并且調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。包括TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、TFIIH、TFIIJ。

    RNA聚合酶（RNA polymerase）是以一條DNA鏈或RNA為模板，三磷酸核糖核苷為底物，通過(guò)磷酸二酯鍵而聚合的合成RNA的酶，包括RNA聚合酶Ⅰ（合成rRNA），RNA聚合酶Ⅱ（合成mRNA），RNA聚合酶Ⅲ（合成tRNA），線粒體RNA聚合酶（合成線粒體RNA）。

    了解完轉(zhuǎn)錄的基本概念和所需的重要的蛋白質(zhì)和酶類后我們來(lái)看看轉(zhuǎn)錄的具體過(guò)程，轉(zhuǎn)錄分為3個(gè)過(guò)程，分別為轉(zhuǎn)錄起始，轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)錄終止。

    起始：RNA聚合酶對(duì)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的DNA序列進(jìn)行辨認(rèn)，同時(shí)打開DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，依賴轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合啟動(dòng)子形成復(fù)合物。

圖三 轉(zhuǎn)錄起始

延長(zhǎng)：合成一段含有60-70個(gè)核苷酸的RNA分子后，RNA聚合酶根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，從5’-3’方向逐個(gè)加入核糖核苷酸，進(jìn)入轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)期。

                                                                                         圖四 轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)

終止：真核生物目前并沒(méi)有明確的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，且3種RNA的合成終止方式不同。對(duì)于mRNA來(lái)說(shuō)，在結(jié)構(gòu)基因的最后一個(gè)外顯子的3’端常有一組共有序列AATAAAA，其下游還有GT序列，這些序列為轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)，當(dāng)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出AAUAAA后，多聚腺苷酸特異因子（CPSF）能識(shí)別并與它結(jié)合，指導(dǎo)前mRNA的切割。在CPSF及切割活化因子（CstF）等因子的指導(dǎo)下，特異的內(nèi)切核酸酶在AAUAAA下游11-30個(gè)核苷酸出切斷RNA鏈， mRNA前體轉(zhuǎn)錄停止。

圖五 轉(zhuǎn)錄終止

 剛轉(zhuǎn)錄出來(lái)的mRNA又被稱為核不均一RNA（hnRNA），該RNA分子量非常大，且僅有10%的部分后期能轉(zhuǎn)變成成熟的RNA，其余部分在轉(zhuǎn)錄后的加工過(guò)程中被降解。其結(jié)構(gòu)為：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、外顯子、內(nèi)含子、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。

    hnRNA又是如何成為成熟的mRNA的呢？這就涉及到mRNA前體物質(zhì)的加工過(guò)程，真核生物mRNA的加工一般包括：mRNA前體剪接，mRNA的修飾（5’加帽和3’多聚腺苷酸化），mRNA編輯。

   5’帽子結(jié)構(gòu)：合成一段RNA后，在鏈5’端加入鳥嘌呤核苷酸且在鳥嘌呤7號(hào)位氮上發(fā)生甲基化形成一個(gè)類似于帽子的結(jié)構(gòu)。帽子結(jié)構(gòu)的生理功能主要是為核糖體識(shí)別mRNA提供了信號(hào)，帽子結(jié)構(gòu)是核糖體識(shí)別mRNA所必須的；帽子結(jié)構(gòu)增加mRNA的穩(wěn)定性，保護(hù)mRNA免受5’外切核酸酶的降解；帽子結(jié)構(gòu)還能有助于成熟的mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)，有助于前體RNA的正確拼接。

    3’多聚腺苷酸尾巴：與hnRNA的形成同步發(fā)生。先由核酸外切酶切去前體RNA的一些核苷酸，再加入polyA尾。多聚腺苷尾巴結(jié)構(gòu)的生理功能主要是提高RNA的穩(wěn)定性；增強(qiáng)RNA的翻譯效率。

    mRNA前體剪接：內(nèi)含子區(qū)段彎曲使外顯子靠近，然后在5’-GU/AG-3’處經(jīng)過(guò)兩次轉(zhuǎn)脂反應(yīng)被剪去后外顯子進(jìn)行拼接。外顯子不同的拼接方式會(huì)導(dǎo)致不同的轉(zhuǎn)錄本（轉(zhuǎn)錄本是由一條基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄形成的一種或多種可供編碼蛋白質(zhì)的成熟的mRNA）的產(chǎn)生，這里就涉及到不同的轉(zhuǎn)錄本問(wèn)題（對(duì)轉(zhuǎn)錄本有研究的小可愛(ài)評(píng)論區(qū)留言，討論）。

  mRNA 編輯：對(duì)外顯子進(jìn)行加工，核苷酸的插入、刪除或轉(zhuǎn)換，從而改變RNA的序列使遺傳信息在mRNA上發(fā)生改變。

 
   經(jīng)過(guò)加過(guò)后前體RNA成為去掉內(nèi)含子，加上帽子結(jié)構(gòu)（GpppmG），加上polyA尾巴的成熟的可被翻譯成蛋白質(zhì)的mRNA。加工過(guò)程如下圖。

                                                                                            圖六 前體RNA的加工成熟過(guò)程
 其結(jié)構(gòu)包括：5’帽子結(jié)構(gòu)、5’UTR區(qū)、CDS區(qū)、3’UTR區(qū)、polyA尾巴。那各個(gè)區(qū)段的含義又是如何，接下來(lái)我們一個(gè)個(gè)來(lái)解釋。

     5’UTR: 5’UTR區(qū)位于帽子結(jié)構(gòu)之后，指從mRNA的一端到編碼序列的起始密碼子之間的一段序列。該區(qū)域可能包起始始密碼子序列、RNA穩(wěn)定性元件和翻譯起始調(diào)控序列。5’UTR是翻譯起始的高度敏感區(qū)，其長(zhǎng)度、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及AUG的數(shù)量都會(huì)影響翻譯起始的效率。

    編碼區(qū)（CDS）：編碼區(qū)包括mRNA的一系列密碼子，它們會(huì)被翻譯成蛋白質(zhì)的氨基酸序列。編碼區(qū)由起始密碼子（通常為AUG）和終止密碼子（例如UAA、UAG或UGA）標(biāo)識(shí)。生物學(xué)中構(gòu)建的各種載體時(shí)所需的引物都是針對(duì)CDS來(lái)設(shè)計(jì)合成的。需要與ORF區(qū)分開來(lái)（開放閱讀框是從起始密碼子到種子密碼子中間的序列。CDS必定是一個(gè)ORF。但也可能包括很多ORF。反之，每個(gè)ORF不一定都是CDS）。

    3’UTR: 3’UTR區(qū)指從編碼序列的終止密碼子到mRNA鏈的末端之間的一段序列。該區(qū)域可能包含穩(wěn)定性元件、調(diào)控序列和終止子序列。

    接下來(lái)根據(jù)成熟信使RNA的核苷酸順序，以3個(gè)核苷酸組成一個(gè)遺傳密碼決定一個(gè)氨基酸的方式合成多肽，從而將mRNA中的遺傳信息轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)氨基酸序列。翻譯過(guò)程同樣涉及許多重要的酶、蛋白因子等。

    核糖體（Ribosome）是翻譯發(fā)生的場(chǎng)所，是翻譯過(guò)程中mRNA結(jié)合tRNA的空穴，有A位（氨酰tRNA進(jìn)入核糖體后占據(jù)的位置）和P位（肽酰tRNA進(jìn)入核糖體后占據(jù)的位置），核糖體包括大小兩個(gè)亞基。

    遺傳密碼（condon）是指mRNA分子上沿5'端到3'端方向，由起始密碼子AUG開始，每三個(gè)核苷酸組成的三聯(lián)體。它決定肽鏈上每一個(gè)氨基酸和各氨基酸的合成順序，以及蛋白質(zhì)合成的起始、延伸和終止，遺傳密碼子分為起始密碼子（AUG）和終止密碼子（UAG、UAA、UGA）。

    tRNA稱為轉(zhuǎn)運(yùn)RNA，既能識(shí)別mRNA上的遺傳密碼，又能與相應(yīng)的氨基酸結(jié)合。tRNA上含有反密碼子，可與密碼子配對(duì)，確保氨基酸的準(zhǔn)確性。在翻譯過(guò)程中tRNA可以跟氨基酸結(jié)合成為氨酰-tRNA（位于核糖體的A位點(diǎn)上），也可以跟肽鏈結(jié)合成為肽酰-tRNA（位于核糖體的P位點(diǎn)上）。

   翻譯過(guò)程中也需要許多的因子來(lái)協(xié)助，包括起始因子（參與蛋白質(zhì)起始復(fù)合物的形成），延長(zhǎng)因子（與氨酰-tRNA及GTP結(jié)合形成復(fù)合物，將氨酰-tRNA轉(zhuǎn)入A位點(diǎn)）和釋放因子（識(shí)別終止密碼子，終止肽鏈的合成釋放肽鏈）。

我們來(lái)了解下翻譯的基本過(guò)程。翻譯的基本過(guò)程也分為三個(gè)：翻譯起始、翻譯延長(zhǎng)、翻譯終止。

    翻譯起始：翻譯過(guò)程主要的事件是起始氨酰-tRNA和mRNA分別與核蛋白體結(jié)合形成翻譯起始復(fù)合物。主要分為以下幾個(gè)步驟，首先核糖體大小亞基分離，核糖體40S小亞基與起始tRNA結(jié)合甲硫氨酸形成起始復(fù)合物前體；同時(shí)由于轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物前體與AUG距離較遠(yuǎn)，因此需要沿著mRNA鏈進(jìn)行掃描，直至第一個(gè)AUG與tRNA的反密碼子配對(duì)，mRNA才準(zhǔn)確定位在核糖體小亞基；核糖體大亞基結(jié)合；當(dāng)起始復(fù)合物前體識(shí)別AUG后，核糖體小亞基在酶的作用下解離，核糖體大亞基結(jié)合，形成翻譯起始復(fù)合物。

    翻譯延長(zhǎng)：主要事件是翻譯起始復(fù)合物形成后，核糖體從mRNA的5’端向3端移動(dòng)，依據(jù)密碼子順序，從N端開始向C端合成多肽鏈。通常分為3個(gè)過(guò)程：進(jìn)位（核糖體A位點(diǎn)上mRNA密碼子所規(guī)定的氨酰-tRNA進(jìn)入核糖體A位點(diǎn)）；轉(zhuǎn)肽（氨酰-tRNA進(jìn)位后，核糖體A位和P位上各結(jié)合了一個(gè)氨酰-tRNA，在酶的催化下，P位上的起始tRNA所攜帶的甲酰甲硫氨?；聂然cA位點(diǎn)的氨基酸的ɑ氨基形成肽鍵）；移位（在延長(zhǎng)因子的催化下，GTP水解為移位提供能量，使mRNA與核糖體相對(duì)移位一個(gè)密碼子的距離，P位上的tRNA從P位釋放，A位上的肽酰-tRNA移到P位，mRNA分子上的第三個(gè)密碼子進(jìn)到A位，為下一個(gè)氨酰-tRNA進(jìn)位做好準(zhǔn)備）。

    翻譯終止：當(dāng)mRNA上出現(xiàn)終止密碼子后，氨酰-tRNA無(wú)法結(jié)合到A位，但釋放位子可以進(jìn)入A位，此時(shí)核糖體上的肽鏈脫落，mRNA與核糖體分離，核糖體解離成大小亞基。

圖七 真核生物翻譯過(guò)程
至此，一個(gè)具有特定生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)合成完成。

    轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程中涉及了非常多的元件，各自的序列也有不同的特點(diǎn)，那我們?nèi)粘Ｊ褂玫谋容^多的序列主要是以下幾種，我們先來(lái)了解一下這些序列平時(shí)的用途。

    啟動(dòng)子序列：轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)；啟動(dòng)子序列對(duì)比及保守性分析。

    CDS序列：不論是PCR還是QPCR，都是根據(jù)CDS序列來(lái)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增以便進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

    UTR區(qū)：對(duì)于研究一個(gè)基因的不同的剪切本有幫助（5’UTR區(qū)含有內(nèi)含子，內(nèi)含子最突出的作用是可以被選擇性剪接，進(jìn)而產(chǎn)生不同功能的蛋白質(zhì)，并且無(wú)論內(nèi)含子處于在基因結(jié)構(gòu)的哪個(gè)位置，均可以調(diào)控基因的表達(dá)并涉及到每一步，包括mRNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯、定位以及衰變等過(guò)程）。miRNA和靶基因的相互作用關(guān)系（雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)）。

    蛋白質(zhì)序列：我們可以將獲取的氨基酸序列用特定發(fā)的蛋白質(zhì)分析軟件進(jìn)行分析，以便我們可以了解蛋白質(zhì)基本性質(zhì)分析；疏水性分析；跨膜區(qū)預(yù)測(cè)；信號(hào)肽預(yù)測(cè)；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；抗原性位點(diǎn)預(yù)測(cè)（相關(guān)網(wǎng)站如下：SCOP蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類數(shù)據(jù)庫(kù)；PDB數(shù)據(jù)庫(kù)；UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)；SWISS-PROT 數(shù)據(jù)庫(kù)；Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)；STING數(shù)據(jù)庫(kù)。（對(duì)這部分內(nèi)容有感興趣的小伙伴可以留言討論）。

 mRNA序列：mRNA序列可用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中siRNA, shRNA的設(shè)計(jì)與合成。

    了解了轉(zhuǎn)錄翻譯的具體過(guò)程以及每個(gè)過(guò)程產(chǎn)物最終的結(jié)構(gòu)，在日常的科研活動(dòng)中經(jīng)常會(huì)遇到需要查找這些結(jié)構(gòu)的序列用于重組載體構(gòu)建或基因編輯以及基因調(diào)控等方面，那又怎么查找這些序列呢？這里我們就要用到一個(gè)功能非常強(qiáng)大的生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)。
NCBI是美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information）的縮寫，它是一個(gè)國(guó)際上權(quán)威的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)。NCBI提供了包括GenBank（DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)）、PubMed（文獻(xiàn)檢索系統(tǒng)）、Nucleotide（核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)）、Genome（基因組數(shù)據(jù)庫(kù)）、Structure（結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)或稱分子模型數(shù)據(jù)庫(kù)）、Taxonomy（生物學(xué)門類數(shù)據(jù)庫(kù)）、PopSet等在內(nèi)的多個(gè)子庫(kù)，涵蓋了生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)的多個(gè)方面，是科研人員的重要資源。
網(wǎng)址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov及網(wǎng)頁(yè)截圖如下：

    Gene序列：打開NCBI，選擇Gene,輸入所需要查找的基因，點(diǎn)擊search, 點(diǎn)擊對(duì)應(yīng)的物種前的基因，找到NCBI Reference Sequence?？梢钥吹紾enomic，直接點(diǎn)擊Genomic下面的FASTA，可下載基因序列。

    mRNA和Protein序列：點(diǎn)擊NM開頭的轉(zhuǎn)錄本，跳轉(zhuǎn)進(jìn)去就是mRNA，點(diǎn)擊Fasta，就可以下載mRNA序列；點(diǎn)擊NP就能得到mRNA對(duì)應(yīng)的蛋白序列。

點(diǎn)擊FASTA，即為mRNA序列：

下翻可見(jiàn)其CDS序列，點(diǎn)擊CDS，CDS序列被標(biāo)記，可復(fù)制CDS序列。

同理蛋白質(zhì)序列可點(diǎn)擊該頁(yè)面的NP編號(hào)，點(diǎn)擊FASTA，即可得到蛋白序列。

啟動(dòng)子序列：進(jìn)入GeneBank，啟動(dòng)子在mRNA的前1500-2000bp左右，因此在左側(cè)的區(qū)段設(shè)置往前1500bp，點(diǎn)擊Update View可得，序列前1500bp即為啟動(dòng)子序列。

UTR序列：找到tool，序列查看，藍(lán)色為5’UTR和3’UTR, 紅色為CDS，綠色為內(nèi)含子。

好了，今天的文獻(xiàn)解讀就到這里，可以推給有需要的朋友或者同學(xué)噢~