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    大家好！今天普拉特澤生物繼續(xù)跟大家一起學(xué)習(xí)新的實(shí)驗(yàn)——細(xì)胞DNA提取步驟。

首先我們看看原理——

    實(shí)驗(yàn)原理DNA是一種帶有負(fù)電荷的高分子聚合物，在水中溶解度較高，但在異丙醇等有機(jī)溶劑中溶解度較低。當(dāng)細(xì)胞裂解后，DNA在水相中溶解，而蛋白質(zhì)和多糖等其他細(xì)胞成分則在有機(jī)相中溶解。異丙醇加入后，改變了溶液中水分子的排列，減少了水分子與DNA之間的氫鍵作用，使得DNA分子間的相互作用增強(qiáng)，從而促使DNA沉淀。另外，異丙醇還能引起蛋白質(zhì)變性，通過(guò)破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，減少蛋白質(zhì)與DNA之間的相互作用，使得DNA更容易從蛋白質(zhì)中分離出來(lái)。異丙醇提取過(guò)程中，許多細(xì)胞內(nèi)的多糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)會(huì)留在水相中，而不與DNA一起沉淀，從而實(shí)現(xiàn)了DNA與這些雜質(zhì)的分離。通過(guò)離心可以收集到含有DNA的沉淀，然后使用70%的乙醇進(jìn)行洗滌，以去除殘留的鹽分和有機(jī)溶劑。最后，DNA沉淀被重懸于適當(dāng)?shù)木彌_液中，得到相對(duì)純凈的DNA樣品。

2.試劑配制及原理

Tris（三羥甲基氨基甲烷）：是一種常用的緩沖劑，能夠維持溶液的pH值相對(duì)穩(wěn)定。在細(xì)胞裂解過(guò)程中，Tris能夠防止pH變化對(duì)酶活性的影響，保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的酶和蛋白質(zhì)在裂解過(guò)程中不被破壞。EDTA（乙二胺四乙酸）：是一種強(qiáng)力的金屬離子螯合劑，能夠與多種金屬離子（如Ca2+、Mg2+、Fe2+等）形成穩(wěn)定的復(fù)合物。在細(xì)胞裂解液中，EDTA可以去除這些金屬離子，防止它們對(duì)酶活性的抑制或激活，以及避免金屬離子催化的氧化反應(yīng)損傷蛋白質(zhì)和核酸。

另外，EDTA通過(guò)螯合金屬離子，可以抑制一些需要金屬離子作為輔因子的核酸酶的活性，從而保護(hù)DNA和RNA不被降解。SDS（十二烷基硫酸鈉）：是一種陰離子表面活性劑，能夠破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)變性。同時(shí)它能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，增加蛋白質(zhì)在溶液中的溶解度，防止蛋白質(zhì)沉淀。

3實(shí)驗(yàn)步驟 1、裂解細(xì)胞：當(dāng)細(xì)胞匯合度≥60%時(shí)，即可提取細(xì)胞的DNA。先吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基，加PBS清洗一遍，然后加入胰酶消化，消化完成后加1mL培養(yǎng)基把細(xì)胞吹打下來(lái)，將細(xì)胞懸液移至干凈的15mL離心管中，1000rpm，3min離心，棄上清。加入5mL（1個(gè)3.5cm皿）細(xì)胞裂解液和50μL蛋白酶K(20mg/mL)吹散細(xì)胞。2、55℃過(guò)夜3、加入等體積的異丙醇(5mL)，上下顛倒混勻，出現(xiàn)DNA沉淀，用槍頭將DNA沉淀挑至新的Ep管中。（若DNA沉淀較少，則需要離心并棄上清）。4、加入1mL新鮮制備的70%的乙醇，上下顛倒10次以洗滌沉淀，離心，棄上清，把物質(zhì)轉(zhuǎn)移到新的Ep管中。5、空離Ep管，晾干。6、加入100μL ddH2O，65℃，1h，溶解DNA。7、檢測(cè)DNA濃度，然后放-20℃保存。

今天關(guān)于細(xì)胞DNA提取步驟就分享到這兒啦~如果您在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遇到技術(shù)問(wèn)題，或者需要實(shí)驗(yàn)外包和代做，可與我們技術(shù)老師聯(lián)系18570028002（微信同號(hào)）