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【科研專題】自噬研究全解析（二）想研究自噬流？這幾種檢測方法你得知道！

大家好！今天普拉特澤生物繼續(xù)跟大家一起學(xué)習(xí)【科研專題】自噬研究全解析（二）。想研究自噬流？這幾種檢測方法你得知道！

自噬，這一細(xì)胞內(nèi)高度保守的降解過程，就像細(xì)胞專屬的 “清潔隊(duì)”，能清除受損的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，在發(fā)育、免疫和疾病發(fā)生發(fā)展等多個(gè)生理、病理過程中扮演關(guān)鍵角色。自噬流，描述的正是自噬發(fā)生過程中，自噬體形成、與溶酶體融合，以及底物降解的這一動(dòng)態(tài)流程。檢測自噬流，對(duì)理解自噬機(jī)制、疾病發(fā)生發(fā)展及尋找干預(yù)靶點(diǎn)至關(guān)重要。

檢測自噬流的方法有多種，以下是一些常見的方法：

電鏡觀察自噬體的形成——自噬檢測金標(biāo)準(zhǔn)

自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，需要使用透射電子顯微鏡觀察自噬體的形態(tài)。

電鏡檢測自噬主要是基于辨認(rèn)自噬體結(jié)構(gòu)特征

Western blot 檢測自噬相關(guān)蛋白

LC3貫穿整個(gè)自噬過程，是目前公認(rèn)的自噬標(biāo)記物。利用WB檢測LC3- 11/I比值的變化以評(píng)估自噬的強(qiáng)弱。LC3-I/II 的形成和降解是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，瞬時(shí)LC3-I I表達(dá)不能反映自噬程度，需增加自噬的抑制劑、自噬的激動(dòng)劑，正反證明自噬的發(fā)生。

p62作為自噬的重要受體，主要依賴于自噬途徑進(jìn)行降解。因此，P62的蛋白水平也常常用來指示自噬的降解情況。

LC3 雙熒光標(biāo)記法：觀測自噬流的神器

mRFP-GFP-LC3 雙熒光自噬指示體系讓自噬研究更上一層樓！自噬流的順暢對(duì)細(xì)胞生理功能至關(guān)重要哦！

這個(gè)方法是用同時(shí)帶有 RFP 和 GFP 的病毒感染細(xì)胞。GFP 在酸性環(huán)境下會(huì)淬滅，而 mRFP 不受影響。當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，會(huì)看到明亮的黃色熒光，這就是被紅色熒光和綠色熒光同時(shí)標(biāo)記的自噬體啦！當(dāng)自噬體和溶酶體融合，pH 值降低，GFP 熒光淬滅，就只能看到紅色熒光了呢！所以，GFP 的減弱表示自噬溶酶體形成順利，GFP 越少，自噬小體到自噬溶酶體的流通就越順暢。反之，融合被抑制，自噬溶酶體進(jìn)程就受阻了哦！而 mRFP 一直穩(wěn)定表達(dá)，通過 GFP 與 mRFP 的熒光比例就能評(píng)價(jià)自噬。

在研究自噬過程中，構(gòu)建自噬雙標(biāo)穩(wěn)株（如mRFP-GFP-LC3系統(tǒng)）需要配套的質(zhì)粒、病毒和抗體工具。以下是普拉特澤生物針對(duì)自噬雙標(biāo)研究的全面推薦，涵蓋質(zhì)粒、病毒和抗體，幫助您高效開展實(shí)驗(yàn)。
常用的病毒工具推薦

（1）慢病毒（Lentivirus）

特點(diǎn)：高效感染多種細(xì)胞類型，可穩(wěn)定整合到基因組中，適合構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系。

推薦病毒：

Lv-LC3B-oe(mCherry,GFP)慢病毒

Lv-LC3-oe(RFP，GFP)慢病毒

以上兩種均可用于構(gòu)建自噬雙標(biāo)穩(wěn)株、監(jiān)測自噬體形成。

（2）腺病毒（Adenovirus）

特點(diǎn)：高感染效率，適合短期表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

推薦病毒：

Adv-LC3B-oe(mCherry,GFP)腺病毒

Adv-LC3B-oe(RFP,GFP)腺病毒

（1）A549-mRFP-GFP-LC3B自噬雙標(biāo)穩(wěn)株