【國自然熱點(diǎn)文獻(xiàn)分享】之表觀遺傳之泛素化
2021-11-18 08:44:58
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺
今天我們?nèi)匀粊矸窒肀碛^遺傳相關(guān)的文獻(xiàn)，那么是分享表觀遺傳的哪一方面呢？
應(yīng)該大家看文獻(xiàn)都會有碰到，那就是越來越火爆的泛素化過程。
當(dāng)然，還是要通過權(quán)威數(shù)據(jù)來說明一下我們?yōu)槭裁匆x擇表觀遺傳的泛素化的文獻(xiàn)進(jìn)行分享。
在pubmed數(shù)據(jù)庫中輸入“ubiquitination”，可以得到的文章數(shù)量為85077篇，并在近20年來都是呈遞增趨勢。
從國自然立項情況來看，特別是近兩年的中標(biāo)情況，與泛素化有關(guān)的課題中標(biāo)率超過200個，基金總金額達(dá)9000多萬元。結(jié)合已發(fā)表的文章數(shù)量以及國自然中標(biāo)情況，表觀遺傳的泛素化方面的研究也是大有搞頭的。
既然泛素化有這么多的科研工作者傾向于去研究，相信看文獻(xiàn)的你也可能值得擁有。那么，首先讓我們來一起了解一下什么是表觀遺傳的泛素化過程？表觀遺傳（Epigenetics）是指，在核酸序列不發(fā)生改變的情況下，遺傳物質(zhì)出現(xiàn)了可遺傳的變化，從而導(dǎo)致可遺傳的表型改變。目前，表觀遺傳學(xué)已從一個少有人關(guān)注的領(lǐng)域變成如今的研究熱點(diǎn)。泛素化是指泛素（一類低分子量的蛋白質(zhì)）分子在一系列特殊的酶作用下（涉及泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3），將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)分類，從中選出靶蛋白分子，并對靶蛋白進(jìn)行特異性修飾的過程。泛素化在蛋白質(zhì)的定位、代謝、功能、調(diào)節(jié)和降解中都起著十分重要的作用。而且，它還參與細(xì)胞周期、增殖、凋亡、分化、轉(zhuǎn)移、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號傳遞、損傷修復(fù)、炎癥免疫等幾乎一切生命活動的調(diào)控。泛素化與多種疾病類型如腫瘤、心血管等發(fā)病密切相關(guān)。因此，泛素化的研究越來越多。
接下來，通過文獻(xiàn)分享的形式來講述泛素化如何在生命過程中參與調(diào)節(jié)。
這次分享的文獻(xiàn)題目是：Ubiquitin-specific protease 2a promotes hepatocellular carcinoma progression via deubiquitination and stabilization of RAB1A，影響因子為6.370分，發(fā)表在Cellular Oncology雜志上，發(fā)表時間為2020年10月，該文章主要探究了泛素特異性蛋白酶2a通過去泛素化和RAB1A的穩(wěn)定促進(jìn)肝癌進(jìn)展。接下來通過作者得到的實驗結(jié)果來分析這篇文章吧!
一、USP2a在HCC中的表達(dá)顯著增加，
并與較差的病理分級、淋巴轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后呈正相關(guān)
首先通過組織芯片（包含100對HCC和匹配的鄰近組織的組織）、免疫組化染色和WB實驗檢測USP2a的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，不管是免疫組化還是WB實驗的結(jié)果都表明USP2a在肝癌組織中表達(dá)顯著增高（Fig 1A-D）；接下來，評估了USP2a表達(dá)與幾種臨床病理特征之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)USP2a表達(dá)與分化不良的病理分級和肝門靜脈淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而USP2a表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小或HBV感染等其他臨床病理特征無顯著相關(guān)性（Table 1）；而且，Kaplan-Meier生存分析顯示USP2a的高表達(dá)與患者預(yù)后較差（Fig 1E）。以上結(jié)果說明，USP2a在肝癌中是一個致癌因子。
二、USP2a顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長
接著，作者在5株肝癌細(xì)胞中檢測了USP2a的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，USP2a在其中3株細(xì)胞中表達(dá)顯著增高，另外兩株無顯著性影響（Fig 2A）。為了進(jìn)一步驗證USP2a在肝癌細(xì)胞的生物學(xué)作用，作者對USP2a進(jìn)行了敲降或過表達(dá)，并在mRNA水平和蛋白水平層面進(jìn)行了效果驗證（Fig 2B-C）。通過功能學(xué)實驗檢測得到，敲降USP2a肝癌細(xì)胞組的生長率、增殖、克隆形成率相比對照組顯著下降，而過表達(dá)USP2a肝癌細(xì)胞組得到的結(jié)果相反（Fig 2D-F）。以上結(jié)果說明，USP2a可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長，進(jìn)一步驗證了USP2a在肝癌中是一個致癌因子。
三、USP2a顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲
有文獻(xiàn)報道，SK-Hep1細(xì)胞被認(rèn)為具有間質(zhì)特征，可導(dǎo)致更多的轉(zhuǎn)移潛能。通過顯微鏡觀察到SK-Hep1細(xì)胞的分布是分散的，但USP2a沉默的SK-Hep1肝癌細(xì)胞開始聚集（Fig 3A）。這一觀察結(jié)果提示USP2a可能參與了HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移。接著，采用劃痕實驗、Transwell遷移和侵襲實驗表明，USP2a沉默的SK-Hep1肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力都弱于對照組，而過表達(dá)USP2a肝癌細(xì)胞的遷移能力則顯著強(qiáng)于對照組（Fig 3B-G）。以上結(jié)果說明，USP2a能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲等生物學(xué)過程，促進(jìn)肝癌的發(fā)展。
四、USP2a在體內(nèi)促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移
通過體外實驗已證實，USP2a可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，那在小鼠體內(nèi)會如何影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展呢？采用SK-Hep1細(xì)胞、USP2a敲降的SK-Hep1細(xì)胞、USP2a過表達(dá)的SK-Hep1細(xì)胞對裸鼠進(jìn)行皮下成瘤，5周后處死小鼠，比較腫瘤的大小。結(jié)果顯示，USP2a敲降組的腫瘤重量遠(yuǎn)輕于對照組，而USP2a過表達(dá)組的腫瘤重量顯著性重于對照組（Fig 4A-B）。同時，在接種USP2a沉默的SK-Hep1細(xì)胞的小鼠腹腔內(nèi)未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，而對照組出現(xiàn)多處轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)（Fig 4C）。通過H&E染色說明所有腫瘤的病理特征均符合惡性病變，USP2a表達(dá)通過免疫組化染色進(jìn)行檢測，USP2a過表達(dá)組的USP2a表達(dá)比對照組更高，而USP2a敲降組比對照組更低（Fig 4D-E）。以上結(jié)果說明，USP2a在小鼠體內(nèi)實驗中促進(jìn)了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。
五、在肝癌細(xì)胞中，USP2a可與RAB1A相互作用
前面的結(jié)果已說明USP2a在肝癌中的作用，但是其具體作用機(jī)制并不清楚。以前有文獻(xiàn)說明USP2a可能通過靶向癌細(xì)胞相關(guān)蛋白參與癌癥進(jìn)展。于是，作者采用免疫沉淀實驗來探索與USP2a可能結(jié)合的蛋白，再通過LC-MS/MS分析得到，從HepG2細(xì)胞中鑒定出210個蛋白，從SKHep1細(xì)胞中鑒定出279個蛋白，其中121個蛋白一致。其中，已有研究報道RAB1A可能促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，因此，作者推測，在這些重疊的蛋白質(zhì)中， RAB1A可能作為USP2a的下游靶標(biāo)（Fig 5A）。免疫共沉淀實驗（Co-IP）說明USP2a能與RAB1A結(jié)合，同時，在SK-Hep1細(xì)胞內(nèi)源性IP實驗發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性RAB1A可以與內(nèi)源性USP2a形成復(fù)合物（Fig 5B-C），免疫熒光染色顯示USP2a和RAB1A共定位于HepG2和SK-Hep1細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（Fig 5D）。以上實驗結(jié)果表明，USP2a可與RAB1A在肝癌細(xì)胞中相互結(jié)合，RAB1A是USP2a的靶基因。
六、USP2a穩(wěn)定RAB1A并防止其降解
雖然USP2a能與RAB1A結(jié)合，但其對生物學(xué)功能的影響還未知。首先，作者通過qPCR實驗檢測了USP2a敲降/過表達(dá)對RAB1A表達(dá)的影響，結(jié)果表明，RAB1A的表達(dá)不受USP2a敲降/過表達(dá)的影響，表達(dá)基本不變（Fig 6A）。然而， USP2a敲降/過表達(dá)顯著影響了RAB1A的蛋白水平，敲降USP2a，RAB1A表達(dá)降低，過表達(dá)USP2a，RAB1A表達(dá)顯著升高（Fig 6B）。以上結(jié)果推測，USP2a可以通過泛素-蛋白酶體途徑抑制靶蛋白的降解。通過CHX追蹤分析，發(fā)現(xiàn)USP2a沉默后，RAB1A在SK-Hep1細(xì)胞中的半衰期降低，而過表達(dá)USP2a，則RAB1A的半衰期延長（Fig 6C-D）。此結(jié)果說明USP2a可以穩(wěn)定RAB1A的表達(dá)。同時，通過MG132（蛋白酶體抑制劑）來說明USP2a對RAB1A泛素化的影響。SKHep1細(xì)胞被攜帶的慢病毒共同感染USP2a/shRNA1或RAB1A，隨后處理MG132持續(xù)6小時。然后提取細(xì)胞中蛋白質(zhì)進(jìn)行IP實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照細(xì)胞相比，USP2a敲降細(xì)胞中RAB1A的K48-特異性多聚泛素化顯著增加，而過表達(dá)USP2a細(xì)胞中則出現(xiàn)相反的結(jié)果（Fig 6E-F）。以上結(jié)果說明，USP2a可以穩(wěn)定RAB1A，并通過去泛素化保護(hù)RAB1A不被降解。
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