【國自然熱點(diǎn)文獻(xiàn)分享】之表觀遺傳之泛素化-高分文章
2021-11-18 08:55:21
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺(tái)
還是按著我們一貫的套路來學(xué)習(xí)和分享這篇泛素化的高分文獻(xiàn)~
這次分享的文獻(xiàn)題目是：CHIP-mediated CIB1 ubiquitination regulated epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis in lung adenocarcinoma，影響因子為15.820分，發(fā)表在Cell Death & Differentiation雜志上，發(fā)表時(shí)間為2020年10月，該文章主要探究了CHIP介導(dǎo)CIB1泛素化過程，從而調(diào)控肺腺癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤的轉(zhuǎn)移。接下來通過作者得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來分析這篇文章吧!一、CIB1在肺腺癌中是一個(gè)促癌因子，跟不良預(yù)后呈正相關(guān)
從作者團(tuán)隊(duì)前面的研究中得到36個(gè)有差異表達(dá)的膜蛋白結(jié)合數(shù)據(jù)庫分析篩選出CIB1作為研究對象。從ONCOMING數(shù)據(jù)庫分析得到，CIB1的表達(dá)顯著增高（Fig 1A），免疫組化檢測作者收集到的肺腺癌組織及相對應(yīng)的正常組織中CIB1的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)CIB1表達(dá)水平明顯增高，而且顯示表達(dá)主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜當(dāng)中（Fig 1B），qPCR實(shí)驗(yàn)檢測CIB1的mRNA水平，結(jié)果也與蛋白水平趨勢一致（Fig 1C），而且，CIB1在肺腺癌細(xì)胞中的mRNA及蛋白表達(dá)水平也顯著高于正常細(xì)胞（Fig 1D-E）。通過臨床分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的CIB1的病人的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更加明顯,以及影響腫瘤分期（Fig 1F-G），而且，CIB1在腫瘤組織中高表達(dá)的患者的總生存期和無病生存期均短于低表達(dá)的患者（Fig 1H-I）。以上結(jié)果說明，CIB1在肺腺癌中高表達(dá)，并且與臨床特征和預(yù)后差密切相關(guān)。
二、體外實(shí)驗(yàn)表明，CIB1可通過AKT途徑促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力，誘導(dǎo)EMT發(fā)生
首先，作者選用了兩株相對高表達(dá)CIB1（PC-9/H1437）以及兩株相對低表達(dá)CIB1的肺腺癌細(xì)胞株（A549/H1299），用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。然后，在A549/H1299細(xì)胞株中過表達(dá)CIB1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)CIB1之后，細(xì)胞的遷移和侵襲能力都大大增強(qiáng)了；相反，在PC-9/H1437細(xì)胞株中，敲低CIB1后，細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著受到抑制（Fig 2A-E）。已經(jīng)有文獻(xiàn)表明， CIB1過表達(dá)可導(dǎo)致AKT的異常激活，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)育；而且AKT通路在多種致癌過程中發(fā)揮核心作用，如與EMT過程密切相關(guān)。因此，作者進(jìn)一步檢測了與AKT通路和EMT過程相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在肺腺癌細(xì)胞中，CIB1可以促進(jìn)肺腺癌中AKT的磷酸化來激活A(yù)KT通路（Fig 2F）。CIB1下調(diào)后，EMT標(biāo)記物N-cadherin、Vimentin表達(dá)下調(diào)，E-cadherin則表達(dá)上調(diào)，說明敲低CIB1后，抑制了肺腺癌細(xì)胞的EMT過程，而過表達(dá)CIB1，則促進(jìn)了其EMT過程（Fig 2F）,同時(shí)，加入AKT通路的抑制劑（MK-2206）之后，過表達(dá)CIB1的細(xì)胞中的N-cadherin、Vimentin表達(dá)受到抑制，而E-cadherin表達(dá)增多，說明阻斷AKT通路后，EMT過程也被阻斷，而在敲低CIB1細(xì)胞不受其影響（Fig 2F）。以上結(jié)果說明，CIB1可通過AKT途徑促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力，誘導(dǎo)EMT發(fā)生。
三、CHIP可與CIB1相互作用并通過泛素-蛋白酶體途徑降低CIB1蛋白水平
為了鑒定與CIB1相互作用的蛋白，使用抗CIB1或IgG抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后使用LS-MS進(jìn)行鑒定。相互作用的蛋白需滿足：在兩個(gè)LC-MS分析中，基于≥2個(gè)多肽以≥95%的置信度且平均比率變化≥1.5。根據(jù)上述條件，有38種蛋白被篩選出來（Fig 3A）。因?yàn)榉核?蛋白酶體系統(tǒng)與蛋白質(zhì)的降解密切相關(guān)，因此選擇CHIP（E3泛素連接酶）用于后續(xù)的研究。采用CHIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)CHIP與CIB1之間能相互結(jié)合（Fig 3B）。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)CHIP與CIB1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有共同表達(dá)（Fig 3H）。在PC-9和HEK293細(xì)胞中過表達(dá)CHIP觀察到CIB1表達(dá)受到抑制(Fig 3C-D)；此外,在HEK293細(xì)胞中觀察到CHIP能以劑量依賴的方式降低CIB1（Fig 3G）。免疫組化染色顯示，60例患者中的CHIP在組織中低表達(dá)，與CIB1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（Fig 3E-F）。采用CHX測量CIB1的半衰期，發(fā)現(xiàn)CHIP降低了CIB1的穩(wěn)定性（Fig 3I）。過表達(dá)Myc-CHIP可下調(diào)CIB1的蛋白水平，但MG-132(蛋白酶體抑制劑)干預(yù)后，CHIP下調(diào)CIB1的蛋白水平被逆轉(zhuǎn)。但是，用leupeptin（蛋白酶抑制劑）干預(yù)并不能逆轉(zhuǎn)（Fig 3J）。以上結(jié)果說明， CHIP誘導(dǎo)的CIB1蛋白水平下降依賴于泛素-蛋白酶體途徑。
四、CHIP通過泛素k48位點(diǎn)促進(jìn)了CIB1的蛋白降解
前面作者已證實(shí)CHIP可能通過泛素化蛋白酶體途徑促進(jìn)CIB1降解。那么是哪個(gè)泛素因子在其中起作用呢。作者通過一系列的蛋白互作實(shí)驗(yàn)找到了關(guān)鍵因子。我們來一起看看吧。首先，作者過表達(dá)CHIP后用CIB1抗體沉淀CIB1蛋白，并用泛素抗體檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染CHIP的細(xì)胞中CIB1泛素化水平明顯高于轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的細(xì)胞（Figure 4A）。此外，當(dāng)將flag-CIB1、HA泛素和Myc-CHIP過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中時(shí)，flag-CIB1的泛素化水平顯著升高（Figure 4B）。接下來，作者構(gòu)建了一個(gè)敲除CHIP的泛素連接酶結(jié)構(gòu)域的CHIP-ΔUbox質(zhì)粒。COIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CHIP-ΔUbox突變體不能增加CIB1的泛素化水平（Figure 4C-D）。此外，體外重組CHIP和CIB1的泛素化分析顯示，CHIP顯著增強(qiáng)了CIB1的泛素化水平（Figure 4F）。最后，分別將K48和K63轉(zhuǎn)移到HEK293細(xì)胞中。K48泛素突變后，CHIP介導(dǎo)的CIB1泛素化消失，而K63突變沒有變化（Figure 4E）。綜上，CHIP通過泛素的Lys-48殘基促進(jìn)CIB1泛素化，從而調(diào)節(jié)CIB1的蛋白表達(dá)。
五、CHIP靶向CIB1的第10位和第65位賴氨酸進(jìn)行泛素化
接下來作者進(jìn)一步探索CIB1上的哪個(gè)賴氨酸可能是導(dǎo)致泛素化修飾的位點(diǎn)。先將CIB1上 的8個(gè)賴氨酸殘基（K10, K24, K65, K70, K83, K107, K150, K188）突變?yōu)轼B氨酸，與帶HA標(biāo)簽的泛素共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。結(jié)果顯示，K10和K65賴氨酸突變后，CIB1的泛素化水平顯著降低（Figure 5A）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在K10和K65同時(shí)突變后，與單個(gè)突變相比，CIB1的泛素化水平顯著減少（Figure 5B）。同時(shí)，當(dāng)K10和K65共突變?yōu)轼B氨酸時(shí)，CHIP過表達(dá)引起Flag-CIB1下調(diào)（Figure 5C）。綜上結(jié)果提示K10和K65可能是CIB1的泛素化位點(diǎn)。
六、CIB1受CHIP的負(fù)調(diào)控，影響肺腺癌細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)移能力
前面的實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了CIB1和CHIP間的相互關(guān)系，接下來就看看CHIP對CIB1介導(dǎo)的肺腺癌遷移和侵襲的影響。Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)CIB1提高了肺腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，而CHIP的過表達(dá)可抑制由過表達(dá)CIB1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，但CHIP-ΔUbox沒有產(chǎn)生相同的效果（Figure 6A-C）。此外，WB結(jié)果顯示CHIP/CIB1亦會(huì)影響P-AKT通路和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子的表達(dá)。CHIP的過表達(dá)可降低由CIB1誘導(dǎo)的p-AKT的表達(dá)。同時(shí)，CIB1可上調(diào)N-Cadherin和Vimentin，下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，而CHIP的過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)上述結(jié)果，但CHIP-ΔUbox不具有逆轉(zhuǎn)功能（Figure 6D）。上述結(jié)果說明，CIB1受CHIP負(fù)調(diào)控，影響肺腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。七、CIB1受CHIP的負(fù)調(diào)控，并影響肺腺癌細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力
前面作者發(fā)現(xiàn)CHIP可以緩解CIB1誘導(dǎo)的LAC增強(qiáng)的體外遷移能力和轉(zhuǎn)移能力，接下來我們看看在體內(nèi)是否可以觀察到同樣的結(jié)果。尾靜脈注射細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)與NC組相比，A549CIB1組小鼠轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。此外，與A549CIB1/CHIP-ΔUbox相比，A549CIB1/CHIP組轉(zhuǎn)移能力降低（Figure 7A -C）。上述結(jié)論在HE和IHC實(shí)驗(yàn)中亦得到了證實(shí)（Figure7D）。同時(shí)，在補(bǔ)充材料中，作者也發(fā)現(xiàn)下調(diào)CHIP表達(dá)能顯著提高CIB1過表達(dá)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移能力。綜上，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)CIB1可以被CHIP負(fù)調(diào)控，影響肺腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。
結(jié)果到這里就已經(jīng)全部分享完噠，相信各位閱讀的朋友們已經(jīng)對這篇文獻(xiàn)的整體思路有了一個(gè)大概的了解。首先，作者通過他們前面的研究中篩選出CIB1這個(gè)蛋白作為研究目標(biāo)，通過對臨床組織進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)以及了解CIB1對肺腺癌的預(yù)后情況，再在細(xì)胞層面上過表達(dá)/敲除CIB1得到其對肺腺癌細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)的影響。其次，通過Co-IP和質(zhì)譜篩選出與CIB1結(jié)合的蛋白CHIP，通過一系列實(shí)驗(yàn)證明了CHIP可以通過泛素-降解途徑影響CIB1的表達(dá)，并得到泛素的K48以及CIB1的K10和K65位點(diǎn)參與CHIP對CIB1的表達(dá)。最后，采用回復(fù)實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞層面和動(dòng)物層面驗(yàn)證CHIP對CIB1的調(diào)控關(guān)系。
好的，本月的兩篇與泛素化相關(guān)的文獻(xiàn)都已分享完畢。
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