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    在講原核和真核載體之前呀，我們需要先開了解一下原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)。上個(gè)視頻中我們說了表達(dá)載體的表達(dá)其實(shí)就是轉(zhuǎn)錄和翻譯，再具體一點(diǎn)呢就是指將外源基因（即非載體本身所固有的基因）導(dǎo)入到細(xì)胞（真核或者原核細(xì)胞）中，并使其在該細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而合成出相應(yīng)的蛋白質(zhì)或RNA分子。目前生物學(xué)上常見的蛋白表達(dá)系統(tǒng)有原核、酵母、昆蟲、植物和哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，其中后面四類（酵母、昆蟲、植物和哺乳動(dòng)物）都為真核表達(dá)系統(tǒng)。接下來咱們就進(jìn)入正題吧。

一、原核表達(dá)體系

首先先看看原核表達(dá)系統(tǒng)。原核表達(dá)系統(tǒng)包括枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)、鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)等，其中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是最常用的原核表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌具有遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達(dá)量高、表達(dá)產(chǎn)物容易純化、穩(wěn)定性好、抗污染能力強(qiáng)以及適用范圍廣等特點(diǎn)，并且很容易使用熱休克等方法轉(zhuǎn)染。在各種表達(dá)系統(tǒng)中，最早被采用進(jìn)行研究的也是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，且大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)以其細(xì)胞繁殖快速產(chǎn)量高、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)相對(duì)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)使其成為生產(chǎn)重組蛋白的最常用的系統(tǒng)。

圖一、原核細(xì)胞結(jié)構(gòu)

對(duì)于表達(dá)不同的蛋白，需要采用不同的載體。已知的大腸桿菌的表達(dá)載體可分為非融合型表達(dá)載體和融合型表達(dá)載體兩種。

1. 融合表達(dá)是將目的蛋白或多肽與另一個(gè)蛋白質(zhì)或多肽片段的DNA序列融合并在菌體內(nèi)表達(dá)。融合型表達(dá)的載體包括分泌表達(dá)載體、帶純化標(biāo)簽的表達(dá)載體、表面呈現(xiàn)表達(dá)載體、帶伴侶的表達(dá)載體。

2. 非融合表達(dá)是將外源基因插入到表達(dá)載體強(qiáng)啟動(dòng)子和有效核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列下游，以外源基因mRNA的AUG為起始翻譯，表達(dá)產(chǎn)物在序列上與天然的目的蛋白一致。

常見的融合型原核表達(dá)載體有：pET系列（如上個(gè)視頻中的pET-28a，還有pET-32a）、PGEX（如pGEX-4T和pGEX-6P-1等）系列和pMAL系列（pMAL-p2x和pMAL-c2X）等。以下面這個(gè)載體為例子，我們可以看到在多克隆位點(diǎn)的C端和N端各有一個(gè)6×His的標(biāo)簽，通過金屬離子親和層析技術(shù)（如鎳柱親和層析），可以方便地將帶有6×His標(biāo)簽的重組蛋白從混合物中分離出來。His標(biāo)簽是多組氨酸標(biāo)簽，6×His標(biāo)簽因其組氨酸殘基的序列可以在特定的緩沖液條件下結(jié)合到幾種類型固定的離子上（如鎳、鈷和銅），從而具有高特異性和高結(jié)合能力。6×His標(biāo)簽的分子量相對(duì)較小，對(duì)目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能影響較小，因此在后面的蛋白純化中一般也不需要將該標(biāo)簽切除。這是pET系列載體普遍會(huì)帶有的標(biāo)簽。

圖二、融合型原核表達(dá)載體pET-28a

而pGEX -4T通常帶有GST標(biāo)簽，GST標(biāo)簽是由谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的基因序列編碼的一段多肽序列，。這段序列通常被融合到目標(biāo)蛋白的N端或C端，用于后續(xù)的純化和檢測(cè)。通過利用谷胱甘肽與GST之間的強(qiáng)親和力，可以使用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠等親和層析材料將帶有GST標(biāo)簽的蛋白從混合物中分離出來。GST標(biāo)簽表達(dá)出來的蛋白分子量比較大，有26KDa，如此大的蛋白質(zhì)會(huì)影響我們目的蛋白的結(jié)構(gòu)，因此在蛋白表達(dá)出來后我們需要使用相應(yīng)的酶將GST標(biāo)簽切下來以得到只含有目的基因表達(dá)出來的蛋白。

圖三、融合型原核表達(dá)載體pGEX-4T-1

常用的非融合型原核表達(dá)系統(tǒng)有：pKK223-3和pBV220系列等。下面以pBV220載體為例。按照定義我們可以得知，非融合型載體不需要帶有標(biāo)簽，因此我們?cè)谳d體中也就看不到相應(yīng)的類似于His或者GST這類的標(biāo)簽，表達(dá)出來的蛋白就是只有目的蛋白，因此后續(xù)也不需要利用標(biāo)簽進(jìn)行純化。原核表達(dá)

圖四、非融合型原核表達(dá)載體pBV220

大腸桿菌表達(dá)體系通常適用于對(duì)于較少需要翻譯后修飾的胞質(zhì)蛋白，因?yàn)榇竽c桿菌蛋白質(zhì)合成和修飾機(jī)制相對(duì)簡(jiǎn)單，缺乏真核生物中復(fù)雜的翻譯后修飾系統(tǒng)，如糖基化、磷酸化等高級(jí)修飾過程，同時(shí)對(duì)于一些跨膜蛋白、糖蛋白以及和細(xì)胞膜結(jié)合的蛋白不太適合大腸桿菌的表達(dá)體系，因?yàn)榇竽c桿菌沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器來促進(jìn)蛋白結(jié)構(gòu)的正確翻譯折疊。因此，如果要表達(dá)真核生物的某些類型蛋白時(shí)，原核表達(dá)體系就失去了它的優(yōu)勢(shì)。那接下來就來看看真核表達(dá)體系。

二、真核表達(dá)體系

剛剛我們講了，真核細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)具有明顯的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)檎婧思?xì)胞不僅具有豐富的翻譯后修飾機(jī)制，同時(shí)具有許多的細(xì)胞器（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體等），能夠產(chǎn)生具有提供天然結(jié)構(gòu)的所有正確翻譯后修飾的真核動(dòng)物蛋白。因此，真核細(xì)胞進(jìn)行重組蛋白制造的表達(dá)系統(tǒng)能夠引入適當(dāng)?shù)?/span>蛋白質(zhì)折疊、翻譯后修飾和蛋白質(zhì)組裝，這對(duì)于蛋白質(zhì)完整的生物活性是非常重要的。通常真核表達(dá)系統(tǒng)主要包括酵母、昆蟲、植物和哺乳動(dòng)物，下面我們就分別講一講常見的這四種真核生物表達(dá)體系以及各自代表性的載體。

圖五、真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)

（一）酵母表達(dá)系統(tǒng)

提到酵母，大家應(yīng)該首先想到的是發(fā)酵，咱們吃的面包、酸奶、米酒這些都是需要經(jīng)過發(fā)酵的。在分子生物學(xué)上，酵母是一種單細(xì)胞低等真核生物，培養(yǎng)條件普通，生長(zhǎng)繁殖速度迅速，能夠耐受較高的流體靜壓，用于表達(dá)基因工程產(chǎn)品時(shí)，可以大規(guī)模生產(chǎn)，有效降低了生產(chǎn)成本。酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種后起的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，由于兼具原核和真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，在基因工程領(lǐng)域中得到日益廣泛的應(yīng)用，應(yīng)用此系統(tǒng)可高水平表達(dá)蛋白，且具有翻譯后修飾功能，故被認(rèn)可為一種表達(dá)大規(guī)模蛋白的強(qiáng)有力的工具。常用的酵母表達(dá)系統(tǒng)有釀酒酵母和甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母。

1. 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)：釀酒酵母在釀酒業(yè)和面包業(yè)的使用已有數(shù)千年的歷史，它不產(chǎn)生毒素。釀酒酵母分為人造釀酒酵母和天然釀酒酵母。天然釀酒酵母具有16條染色體，其基因組包含大約1200萬堿基對(duì)，分成16組染色體，共有6275個(gè)基因。這些染色體在細(xì)胞內(nèi)以特定的方式排列和組合，維持著酵母細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和功能。而通過科學(xué)家的努力，特別是通過染色體融合技術(shù)的發(fā)明，人類成功創(chuàng)建了只有一條染色體的釀酒酵母菌株。這種人造酵母將原本分散在16條染色體上的所有遺傳信息整合到了一條染色體上，但仍保持了與天然酵母相似的生長(zhǎng)形態(tài)和功能。但是，釀酒酵母蛋白質(zhì)表達(dá)量較低，易產(chǎn)生過量糖基化，轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定，易發(fā)生質(zhì)粒丟失，因此目前應(yīng)用最多的是甲醇型酵母。

圖六、人造釀酒酵母和天然釀酒酵母

2. 甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)：甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)。甲醇酵母主要有漢森酵母屬，畢赤酵母屬，球擬酵母屬等，并以畢赤酵母屬應(yīng)用最多。甲醇酵母一般先在含甘油的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。培養(yǎng)至高濃度。再以甲醇為碳源。誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白。這樣可以大大提高表達(dá)產(chǎn)量。利用甲醇酵母表達(dá)外源性蛋白質(zhì)其產(chǎn)量往往可達(dá)克級(jí)，與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動(dòng)物細(xì)胞，不會(huì)發(fā)生超糖基化。

了解完酵母表達(dá)體系的相關(guān)知識(shí)后，我們來看下酵母的表達(dá)載體。酵母表達(dá)載體指外源基因在酵母細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增和表達(dá)的載體。甲醇酵母的表達(dá)載體為整合型質(zhì)粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中，大部分甲醇酵母的表達(dá)載體中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因(AOX1)，在該基因的啟動(dòng)子(PAOX1)作用下，外源基因得以表達(dá)。

甲醇酵母載體通常包括選擇標(biāo)記、調(diào)控序列。其中選擇標(biāo)記是載體轉(zhuǎn)化酵母時(shí)篩選轉(zhuǎn)化子所必須的元件，用于重組子的篩選和鑒定。選擇標(biāo)記可分為兩類：

a. 營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記：如HIS3，HIS4，LEU2，LYS2，TRP1，URA3等；（營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記是指利用宿主為營(yíng)養(yǎng)缺陷型，即該宿主細(xì)胞由于基因突變等原因無法合成某種生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如氨基酸、維生素等），而我們目的質(zhì)粒上則帶有合成此物質(zhì)的基因，在篩選過程中，將質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并置于不含該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基中。只有成功導(dǎo)入了質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，由于質(zhì)粒上攜帶的合成該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的基因得以表達(dá)，從而能夠在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖，形成可見的菌落或生長(zhǎng)跡象。）

b. 抗生素篩選標(biāo)記：氯霉素，G418，Zeocin等。（抗生素篩選標(biāo)記則是利用質(zhì)粒上攜帶的抗生素抗性基因來進(jìn)行篩選的。這種抗性基因編碼了一個(gè)蛋白質(zhì)，使得細(xì)菌或宿主細(xì)胞對(duì)某種特定的抗生素具有耐藥性，在篩選過程中，將質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，再將細(xì)胞置于含有該抗生素的培養(yǎng)基中。由于只有成功導(dǎo)入了帶有抗生素抗性基因的質(zhì)粒的細(xì)胞才能在含有抗生素的培養(yǎng)基中生存下來，因此可以通過觀察培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況來篩選出成功導(dǎo)入了目標(biāo)質(zhì)粒的細(xì)胞。）

在釀酒酵母和乳酸克魯維酵母中，LEU2基因和G418抗性基因是最常用，對(duì)于解脂耶氏酵母，主要使用LEU2和URA3基因。而在畢赤酵母中，最常使用的篩選標(biāo)記是HIS4和zeocin。調(diào)控序列包括啟動(dòng)子、ARS（酵母復(fù)制起始區(qū)）等，其中啟動(dòng)子可分為兩類（組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子）。組成型啟動(dòng)子提供簡(jiǎn)單性和相對(duì)恒定的表達(dá)水平，而當(dāng)需要分離生長(zhǎng)和生產(chǎn)時(shí)通常使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，這能防止無意中選擇生長(zhǎng)較快的非重組細(xì)胞或產(chǎn)生毒性蛋白。不同的受體細(xì)胞常用的啟動(dòng)子如表中所示。

在真核蛋白表達(dá)中用的最多的酵母表達(dá)系統(tǒng)是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，包括分泌型表達(dá)載體和非分泌型表達(dá)載體兩種。那么這兩種載體分別是什么呢？在基因工程中，分泌型表達(dá)載體在畢赤酵母中能夠指導(dǎo)外源蛋白分泌到細(xì)胞外，非分泌型則用于在畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白，這些蛋白通常留在細(xì)胞內(nèi)而不被分泌到細(xì)胞外，這類載體適用于那些需要在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行特定修飾或功能驗(yàn)證的蛋白質(zhì)。分泌型表達(dá)載體和非分泌型表達(dá)載體的主要區(qū)別在于它們指導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)的位置不同。分泌型表達(dá)載體將蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外，便于后續(xù)的分離純化和應(yīng)用；而非分泌型表達(dá)載體則將蛋白質(zhì)留在細(xì)胞內(nèi)，適用于細(xì)胞內(nèi)功能研究或需要進(jìn)一步細(xì)胞內(nèi)加工的蛋白質(zhì)。因此咱們可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的來選擇載體的種類。

畢赤酵母分泌表達(dá)載體的一個(gè)典型例子是pPICZα 系列載體，該系列包含A、B和C載體。下圖是pPICZα A的載體圖譜，我們一個(gè)個(gè)元件來看：pPICZα A載體包含以下元素：AOX1 啟動(dòng)子（對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行嚴(yán)格調(diào)控，位于載體的5'端，是一個(gè)嚴(yán)格調(diào)控的啟動(dòng)子，能夠利用甲醇誘導(dǎo)高效表達(dá)目的基因）、用于重組蛋白分泌的α-因子分泌信號(hào)（編碼釀酒酵母α-因子分泌信號(hào)，該信號(hào)序列能夠引導(dǎo)重組蛋白的分泌性表達(dá)。這段前導(dǎo)肽序列在蛋白質(zhì)翻譯過程中被合成，并作為信號(hào)肽引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)通過細(xì)胞膜的分泌途徑。在分泌過程中，信號(hào)肽被特定的酶切割，而重組蛋白的其余部分則被釋放到細(xì)胞外。）、BIeoR博來霉素抗性基因（用于大腸桿菌和畢赤酵母中的篩選，該基因的序列使得攜帶pPICZα A載體的細(xì)胞能夠在含有博來霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)）、標(biāo)簽的 C 端肽用于檢測(cè)和純化重組融合蛋白（包括Myc和His標(biāo)簽，這些標(biāo)簽位于目的基因的下游，用于重組蛋白的檢測(cè)和純化，同時(shí)Myc和His標(biāo)簽的序列是已知的，可以在蛋白質(zhì)純化過程中作為識(shí)別和結(jié)合的靶點(diǎn)）、AOX1轉(zhuǎn)錄終止子（位于載體的3'端，確保mRNA的正確終止，轉(zhuǎn)錄終止子序列包含特定的終止信號(hào)，如多聚腺苷酸化信號(hào)等，polyA尾巴是真核生物特有的，在也是成熟信使RNA的標(biāo)志之一，也是咱們判斷一個(gè)載體是不是真核載體的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)）。

圖七、畢赤酵母分泌型載體pPICZαA

畢赤酵母非分泌型表達(dá)載體的一個(gè)典型例子是pGAPZ 系列，該系列包含A，B，和C載體，都使用GAP啟動(dòng)子在畢赤酵母中穩(wěn)定表達(dá)重組蛋白。GAP啟動(dòng)子的重組蛋白表達(dá)水平略高于AOX1啟動(dòng)子。同時(shí)也含有BIeoR博來霉素抗性基因，該載體同樣帶有Myc和His標(biāo)簽，后續(xù)可以對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化。其實(shí)大部分的結(jié)構(gòu)元件跟上面那個(gè)載體一樣，其中最大的區(qū)別在于分泌型載體上帶有的α-因子分泌信號(hào)在非分泌型載體上不存在，這也是分泌型載體之所以叫分泌型載體的原因。

圖八、畢赤酵母非分泌型載體pGAPZ A

（二）昆蟲表達(dá)系統(tǒng)

昆蟲表達(dá)系統(tǒng)是一類應(yīng)用廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)，它具有同大多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾加工以及轉(zhuǎn)移外源蛋白的能力。昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的原理主要基于桿狀病毒的特性。什么叫桿狀病毒呢？桿狀病毒是一類閉合環(huán)狀雙鏈病毒，以昆蟲為主要宿主。通過將目標(biāo)蛋白質(zhì)編碼序列克隆至合適的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體上，目的基因與桿狀病毒的基因組通過同源重組或轉(zhuǎn)座作用制備重組病毒DNA。隨后，該重組病毒DNA感染昆蟲細(xì)胞或蟲體，外源基因隨著病毒的復(fù)制而產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)。

昆蟲表達(dá)系統(tǒng)具有真核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后加工功能，如二硫鍵的形成、糖基化及磷酸化等，使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白；其最高表達(dá)量可達(dá)昆蟲細(xì)胞蛋白總量的50%；可表達(dá)非常大的外源性蛋白(可達(dá)200kD)；具有在同一個(gè)感染昆蟲細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因的能力；對(duì)脊椎動(dòng)物是安全的。由于病毒多角體蛋白在病毒總蛋白中的含量非常高，至今已有很多外源基因在此蛋白的強(qiáng)大啟動(dòng)子作用下獲得高效表達(dá)。

常見的昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)包括Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)和MultiBac表達(dá)系統(tǒng)。

Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)：根據(jù) F 因子載體原理，用類似于酵母體內(nèi)重組的方法，構(gòu)建了一種桿狀病毒穿梭載體Bacmid。常用的載體為pFastBac載體該載體可像質(zhì)粒一樣在大腸桿菌中生長(zhǎng)，又對(duì)鱗翅目昆蟲細(xì)胞具有感染性。Bacmid含有 F 因子復(fù)制子( 可在大腸桿菌中復(fù)制) 、卡那霉素抗性基因，同時(shí)包含Tn7轉(zhuǎn)座元件，這是一種能夠?qū)⒛康幕蛲ㄟ^轉(zhuǎn)座方式整合到大腸桿菌Bacmid質(zhì)粒上特定位點(diǎn)的元件（轉(zhuǎn)座是指DNA序列在基因組中從一個(gè)位置移動(dòng)到另一個(gè)位置的過程，這個(gè)過程涉及到DNA序列的復(fù)制（在某些類型的轉(zhuǎn)座中）和隨后在基因組新位置的插入。轉(zhuǎn)座是生物體內(nèi)一種重要的遺傳變異機(jī)制，能夠?qū)е禄蚪M的重排和基因表達(dá)的調(diào)控變化。轉(zhuǎn)座子則是執(zhí)行轉(zhuǎn)座過程的DNA序列），這一特性使得pFastBac載體能夠方便地與Bacmid穿梭載體結(jié)合，進(jìn)而在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生重組病毒。

圖九、昆蟲系統(tǒng)表達(dá)載體pFastBac

圖十、Bac-to-Bac系統(tǒng) pFastBac載體構(gòu)建流程

MultiBac表達(dá)系統(tǒng)：MultiBac是一種先進(jìn)的桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)，已被開發(fā)并用于生產(chǎn)具有許多亞基的多蛋白復(fù)合物，用于學(xué)術(shù)和工業(yè)研究與開發(fā)。MultiBac由針對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合物生產(chǎn)進(jìn)行優(yōu)化的工程桿狀病毒組成。這種MultiBac桿狀病毒基因組以大腸桿菌中的細(xì)菌人工染色體（BAC）存在。它包含兩個(gè)外源基因整合位點(diǎn)，通過Tn7，或者通過Cre酶介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組。MultiBac進(jìn)一步由一系列質(zhì)粒組成，這些質(zhì)粒稱為受體和供體，可促進(jìn)多基因組裝。MultiBac桿狀病毒（中心）是通過在昆蟲細(xì)胞中轉(zhuǎn)染復(fù)合MultiBac BAC產(chǎn)生的。MultiBac已成功用于基礎(chǔ)和應(yīng)用研究與開發(fā)中的各種應(yīng)用程序。目的基因顯示為白色箭頭。紅色圓圈表示LoxP。復(fù)制起點(diǎn)顯示為矩形。

圖十一、MultiBacc系統(tǒng)載體構(gòu)建流程

（三）哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源重組蛋白可利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和病毒載體的感染。利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞需幾周甚至幾個(gè)月時(shí)間，而利用病毒表達(dá)系統(tǒng)則可快速感染細(xì)胞，在幾天內(nèi)使外源基因整合到病毒載體中，尤其適用于從大量表達(dá)產(chǎn)物中檢測(cè)出目的蛋白。根據(jù)目的蛋白表達(dá)的時(shí)空差異，可將哺乳動(dòng)物的表達(dá)系統(tǒng)分為瞬時(shí)、穩(wěn)定和誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。

1. 瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)是指宿主細(xì)胞在導(dǎo)入表達(dá)載體后不經(jīng)選擇培養(yǎng)，載體DNA隨細(xì)胞分裂而逐漸丟失，目的蛋白的表達(dá)時(shí)限短暫；瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)捷，實(shí)驗(yàn)周期短。

2. 穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)是指載體進(jìn)入宿主細(xì)胞并經(jīng)選擇培養(yǎng)，載體DNA穩(wěn)定存在于細(xì)胞內(nèi)，目的蛋白的表達(dá)持久、穩(wěn)定。由于需抗性選擇甚至加壓擴(kuò)增等步驟，穩(wěn)定表達(dá)相對(duì)耗時(shí)耗力。

3. 誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)是指目的基因的轉(zhuǎn)錄受外源小分子誘導(dǎo)后才得以開放。采用異源啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和可擴(kuò)增的遺傳標(biāo)記，可提高蛋白產(chǎn)量。

哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)在蛋白的起始信號(hào)、加工、分泌、糖基化方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，適合表達(dá)完整的大分子蛋白。由哺乳動(dòng)物細(xì)胞翻譯后再加工修飾產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)，在活性方面遠(yuǎn)勝于原核表達(dá)系統(tǒng)及酵母、昆蟲細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)，更接近于天然蛋白質(zhì)，但構(gòu)成復(fù)雜、操作技術(shù)要求高、表達(dá)產(chǎn)量不大、產(chǎn)率低，且有時(shí)會(huì)導(dǎo)致病毒感染等是該表達(dá)系統(tǒng)的不足之處。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體必須包含原核序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記基因、終止子和多聚核苷酸信號(hào)等控制元件。接下來一起來看看具體的元件及其功能。

1.原核序列中包括：原核復(fù)制子、抗生素抗性基因及多克隆位點(diǎn)。

2.啟動(dòng)子（分為兩類）：病毒來源:SV40（綠猴空泡病毒）、CMV（巨細(xì)胞病毒）、RSV（肉瘤病毒）、ADV（腺病毒）、LTR（逆轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列）；細(xì)胞來源:HSP（熱休克蛋白）等。

3.增強(qiáng)子：有些含有增強(qiáng)子。常用增強(qiáng)子：SV40 enhancer、CMV enhancer、RSV enhancer、LTR enhancer。

4.終止信號(hào)和poly A信號(hào)：功能是使轉(zhuǎn)錄后的mRNA能有效進(jìn)行切割和加上polyA尾巴也就是多聚腺苷化，poly A增加mRNA的的穩(wěn)定性。

5.選擇標(biāo)記基因：胸苷激酶基因(tk)、二氫葉酸還原酶基因 (dhfr)、新霉素抗性基因(neo)和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat) 。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體類型分為兩類：非病毒載體（質(zhì)粒）和病毒載體（腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒）等。

（1）非病毒載體：由真核復(fù)制信號(hào)、啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄單位以及質(zhì)粒片段組成，不需要包裝細(xì)胞，比如pSV系列、pCDNA3等。接下來介紹一下常用的pcDNA3載體。pcDNA3載體可用于在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)高水平、組成型表達(dá)。包含可選標(biāo)記物和多克隆位點(diǎn)，具有以下特點(diǎn)：具備高水平表達(dá)蛋白的巨細(xì)胞病毒(CMV)增強(qiáng)子啟動(dòng)子；正向 (+) 或反向 (-) 的大分子多克隆位點(diǎn)；牛生長(zhǎng)激素(BGH)多聚腺苷酸化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列用于增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性；氨芐青霉素耐藥基因和pUC復(fù)制區(qū)序列用于大腸桿菌中的選擇和維持。

圖十二、哺乳動(dòng)物非病毒載體pcDNA3

（2）病毒型載體：病毒型載體的類型分為兩類，即整合型和游離型。整合型：整合入宿主染色體隨染色體復(fù)制而復(fù)制，可持續(xù)表達(dá)外源基因；安全性低，可能會(huì)整合到基因編碼區(qū)導(dǎo)致插入誘變。如：慢病毒載體等。游離型：不整合、生物安全性高、瞬時(shí)表達(dá)。如腺病毒載體。下圖展示了慢病毒和腺病毒的載體圖譜。那我們?cè)撊绾蝸矸直嬉粋€(gè)載體是整合型的還是非整合型的，雖然載體圖譜本身可能不直接標(biāo)注“整合型”或“非整合型”的字樣，但通過分析圖譜中的信息，我們可以間接推斷出載體的類型。整合型病毒載體（如慢病毒）的圖譜中可能會(huì)包含病毒整合酶基因（如HIV-1中的IN基因）的相關(guān)片段，這些基因?qū)τ诓《菊系剿拗骰蚪M中是必需的，非整合型病毒載體（如腺病毒）的圖譜中則較少或不會(huì)包含這類與整合相關(guān)的病毒結(jié)構(gòu)基因。同時(shí)還有一些特殊的表達(dá)元件，如慢病毒載體上帶有的cPPT（來自HIV-1整合酶基因）和WPRE（來自土撥鼠肝炎病毒的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件），這些元件有助于增加病毒在宿主基因組的拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率，腺病毒則不會(huì)帶有這些，

圖十三、整合型慢病毒載體和非整合型腺病毒載體

（四）植物表達(dá)系統(tǒng)

植物表達(dá)系統(tǒng)基于植物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化能力，通過構(gòu)建含有目標(biāo)基因的表達(dá)載體，將其導(dǎo)入植物細(xì)胞或組織，并利用植物體內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的高效表達(dá)。這一過程通常包括載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、篩選和鑒定轉(zhuǎn)化體以及目標(biāo)基因的表達(dá)和功能分析等步驟。下圖展示了利用農(nóng)桿菌侵染法將目的基因?qū)氲今R鈴薯中的流程，在這里就不展開講述了。

圖十四、植物表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建過程

好了，講了這么多，大家估計(jì)腦子里是一團(tuán)亂麻，下表給大家匯總了各種表達(dá)體系的特點(diǎn)及其優(yōu)缺點(diǎn)，有需要的小伙伴可以自行截圖保存。本期內(nèi)容就到這結(jié)束了，跪求大家一鍵三連呀，下期咱們講講真核
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