RNA干擾技術(shù)
2024-11-12 11:47:38
來(lái)源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺(tái)
在基因功能研究過(guò)程中，我們常常會(huì)用到基因干擾技術(shù)。盡管大部分人可能聽(tīng)說(shuō)過(guò)RNA干擾技術(shù)，但是對(duì)它的了解可能還停留在找生物公司合成序列進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（交給生物公司一段序列，然后生物公司合成，寄回合成的干擾RNA，再按照師兄師姐祖?zhèn)飨聛?lái)的實(shí)驗(yàn)操作步驟像個(gè)無(wú)情的機(jī)器人一樣一步步操作，然后就會(huì)發(fā)現(xiàn)：怎么這個(gè)東西對(duì)我的基因毫無(wú)干擾效果啊，然后開(kāi)始去找生物公司麻煩，要求退款），對(duì)這項(xiàng)技術(shù)背后的奧秘卻往往一知半解，更有甚者一無(wú)所知。但其實(shí)這項(xiàng)技術(shù)不僅揭示了生命體內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性，更為疾病治療、基因編輯等領(lǐng)域帶來(lái)了革命性的突破，絕對(duì)不僅僅是咱們下個(gè)單合成后按照步驟操作那么簡(jiǎn)單。那本期文章將帶大家深入了解RNA干擾技術(shù)的起源、發(fā)展歷程、作用機(jī)制以及廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域，希望能給剛接觸RNA干擾技術(shù)的小伙伴們提供一些，除蒙著頭做實(shí)驗(yàn)外的一些答疑解惑，同時(shí)，也為科研工作者提供一些有價(jià)值的參考與啟示
在之前學(xué)習(xí)中，我們學(xué)習(xí)了基因表達(dá)，如果我們將基因表達(dá)比喻為河流中的水流，而基因干擾技術(shù)則如同河流中的調(diào)控閘門。在正常情況下，基因按照其內(nèi)在的邏輯和節(jié)奏進(jìn)行表達(dá)，猶如河流中的水流按照地勢(shì)和氣候的自然規(guī)律流淌。然而，當(dāng)我們需要在某些特定情境下調(diào)節(jié)或阻斷某些基因的表達(dá)時(shí)，基因干擾技術(shù)便如同調(diào)控閘門一樣發(fā)揮作用。這個(gè)調(diào)控閘門通過(guò)接收特定的指令（如RNA干擾技術(shù)中的小分子RNA，如siRNA、shRNA或者miRNA），能夠精確地識(shí)別并鎖定特定的mRNA分子。一旦這些mRNA分子被鎖定，它們就會(huì)被引導(dǎo)至降解途徑，相當(dāng)于水流被閘門截?cái)?。這樣一來(lái)，特定的基因表達(dá)就被“閘門”阻擋，實(shí)現(xiàn)了對(duì)該基因活動(dòng)的抑制或完全阻斷，從而達(dá)到我們期望的調(diào)控效果。
了解完之后相信大家對(duì)于RNA干擾的機(jī)制還處于一知半解的狀態(tài)，別著急，接下來(lái)我們帶大家一起來(lái)學(xué)習(xí)并參透其中的奧秘。
RNA干擾現(xiàn)象是一種古老而普遍的生命現(xiàn)象。早在1988年代初，科學(xué)家們就開(kāi)始注意到：雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象，而后在植物和真菌中相繼發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象，科學(xué)家們將其命名為RNA干擾。（。之后他們發(fā)現(xiàn)從單細(xì)胞生物到復(fù)雜的動(dòng)植物（如秀麗新小桿線蟲(chóng)、真菌、果蠅、擬南芥、錐蟲(chóng)、水螅、渦蟲(chóng)、斑馬魚(yú)以及人類等真核生物），無(wú)一不存在RNA干擾的現(xiàn)象，通過(guò)這些結(jié)果，科學(xué)家們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，這絕不是小部分的偶然事件，而是生命體中的，一種普遍存在的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。因此科學(xué)家們開(kāi)始思考，為什么生物體會(huì)進(jìn)化出RNA干擾這樣的機(jī)制呢？這背后究竟隱藏著怎樣的生命奧秘呢？
首先，我們需要從細(xì)胞的生活環(huán)境說(shuō)起。細(xì)胞作為生命的基本單位，在漫長(zhǎng)的進(jìn)化歷程中面臨著來(lái)自病毒、細(xì)菌等外來(lái)病原體的不斷侵?jǐn)_。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)被病毒RNA侵?jǐn)_的細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)，這個(gè)幸運(yùn)的細(xì)胞可能恰好擁有一條與病毒RNA互補(bǔ)配對(duì)的序列，這條序列就像一把精準(zhǔn)的鑰匙，能夠識(shí)別并結(jié)合病毒RNA，啟動(dòng)降解過(guò)程，將其轉(zhuǎn)化為無(wú)害的碎片。這種偶然但關(guān)鍵的互補(bǔ)配對(duì)，為細(xì)胞提供了一種自我保護(hù)機(jī)制，即RNA干擾。而有些倒霉蛋細(xì)胞，它們沒(méi)有這條“幸運(yùn)”序列，因此無(wú)法有效抵御病毒的入侵，從而更容易被病毒消滅，這也是達(dá)爾文自然選擇、適者生存法則在微觀世界的體現(xiàn)。隨著時(shí)間的推移，越來(lái)越多的細(xì)胞發(fā)覺(jué)要想不做倒霉蛋，不被病毒RNA消滅，就必須要進(jìn)化出這種RNA干擾機(jī)制。它們不僅能夠識(shí)別并降解病毒RNA，還能夠調(diào)節(jié)自身基因的表達(dá)，從而適應(yīng)不同的環(huán)境變化。
在siRNA和shRNA還未發(fā)現(xiàn)之前，RNA干擾的主角是天然存在于生物體內(nèi)的miRNA。前體miRNA經(jīng)過(guò)一系列的加工過(guò)程最后得到了成熟的miRNA，隨后成熟的miRNA再和特定的蛋白質(zhì)（RISL蛋白）形成了一個(gè)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體RISC。RISC在細(xì)胞質(zhì)中巡邏，尋找著與其攜帶的miRNA互補(bǔ)的mRNA。一旦一個(gè)靶mRNA與miRNA形成堿基配對(duì)，該mRNA就會(huì)瞬間被存在于RISC中的核酸酶降解掉，一旦RISC解決好了一個(gè)mRNA分子后，RISC便得到了解放，就可以著手于再去尋找新的mRNA分子，由此高效的阻斷mRNA編碼的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，根據(jù)配對(duì)程度的不同，靶mRNA要么在RISC中被核酸酶降解，要么就被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中被其他的細(xì)胞核酸酶所摧毀。
如何來(lái)理解這個(gè)過(guò)程呢？我們可以把RISC復(fù)合體看做城市里的特工隊(duì)：RISC特工隊(duì)在細(xì)胞質(zhì)這個(gè)繁忙的城市中巡邏，他們的任務(wù)是搜尋那些與miRNA“密碼”相匹配的mRNA“嫌疑犯”。每當(dāng)RISC發(fā)現(xiàn)一個(gè)可以與miRNA配對(duì)的mRNA目標(biāo)時(shí)，隊(duì)伍中的“核酸酶特工”會(huì)立即采取行動(dòng)。根據(jù)“嫌疑犯”的“罪行”輕重（即配對(duì)程度的不同），RISC有兩種處理方式：一種是直接在現(xiàn)場(chǎng)（RISC內(nèi)部）用核酸酶將其“逮捕并銷毀”；另一種則是將其“移送”到細(xì)胞質(zhì)的其他區(qū)域，由其他“細(xì)胞核酸酶警察”進(jìn)行進(jìn)一步的處理和摧毀。一旦RISC成功處理完一個(gè)mRNA分子，他們就如同完成了一次任務(wù)，重新整裝待發(fā)，繼續(xù)在城市中巡邏，尋找下一個(gè)目標(biāo)。這樣的工作方式讓RISC能夠高效地阻止mRNA所編碼的蛋白質(zhì)“罪犯”的產(chǎn)生，從而維護(hù)細(xì)胞內(nèi)的基因秩序和安全。
在RNA干擾包括許多的小分子RNA如miRNA、siRNA和shRNA，其中miRNA（微小RNA）無(wú)疑是最耀眼引人注目的一類。在今年的10月7日，諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)頒發(fā)給了美國(guó)的兩位科學(xué)家（Victor Ambros和Gary Ruvkun），他們因發(fā)現(xiàn)microRNA及其在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中的作用而共同獲得這一獎(jiǎng)項(xiàng)，這一事件更是將miRNA的研究推向了新的熱潮。那么，miRNA究竟是什么呢？
miRNA是一類長(zhǎng)度約為20-25個(gè)核苷酸的非編碼內(nèi)源性RNA分子。它們廣泛存在于生物體內(nèi)，通過(guò)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)來(lái)參與多種生物過(guò)程。盡管大家可能只知道miRNA能夠與靶基因的3’UTR區(qū)配對(duì)并降解mRNA，但miRNA的功能遠(yuǎn)不止于此。事實(shí)上，miRNA具有多種功能，包括阻止翻譯過(guò)程、降低RNA的穩(wěn)定性以及在某些情況下激活翻譯等。
阻止翻譯過(guò)程：當(dāng)miRNA與靶mRNA的3’UTR部分互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，它們會(huì)形成一個(gè)雙鏈結(jié)構(gòu)。這個(gè)結(jié)構(gòu)會(huì)阻止核糖體與mRNA的結(jié)合，從而抑制翻譯過(guò)程的起始。即使核糖體已經(jīng)與mRNA結(jié)合，miRNA也可以干擾tRNA對(duì)密碼子的識(shí)別，導(dǎo)致翻譯過(guò)程的提前終止。
降低RNA的穩(wěn)定性：除了抑制翻譯，miRNA還可以通過(guò)誘導(dǎo)靶mRNA的降解來(lái)降低其穩(wěn)定性。這通常發(fā)生在miRNA與靶mRNA的序列部分互補(bǔ)但并非完全互補(bǔ)的情況下。通過(guò)結(jié)合特定的酶（如Dicer酶和RISC復(fù)合體），miRNA可以引導(dǎo)這些酶對(duì)靶mRNA進(jìn)行切割，從而使其降解。
在某些情況下激活翻譯：近期的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA并非總是抑制翻譯。在某些情況下，它們也可以激活翻譯。這通常發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，通過(guò)結(jié)合增強(qiáng)子來(lái)激活基因表達(dá)，這種miRNA被稱為NamiRNA（nuclear activating miRNA）。然而，這種激活作用的具體機(jī)制尚不完全清楚，需要進(jìn)一步的研究來(lái)揭示。
一般來(lái)說(shuō)，這些不同功能的實(shí)現(xiàn)，取決于miRNA與靶基因之間的，互補(bǔ)配對(duì)的堿基數(shù)目的多少即配對(duì)的程度。當(dāng)miRNA與靶mRNA的3’UTR區(qū)部分互補(bǔ)時(shí)，它們就會(huì)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并抑制翻譯過(guò)程；而當(dāng)miRNA與靶mRNA的序列完全互補(bǔ)時(shí)，它們就會(huì)直接降解靶mRNA。也就是說(shuō)互補(bǔ)配對(duì)的堿基越多，基因干擾的效果就越好。
然而，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中會(huì)發(fā)現(xiàn)一個(gè)有趣的現(xiàn)象是：當(dāng)我們在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miRNA后，其QCR（定量反轉(zhuǎn)錄PCR）結(jié)果不顯著，但是蛋白水平卻顯著下降呢？這主要是因?yàn)?/span>miRNA的作用機(jī)制是在轉(zhuǎn)錄后水平上進(jìn)行調(diào)節(jié)的。即使mRNA的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著變化，miRNA仍然可以通過(guò)抑制翻譯過(guò)程或降解mRNA來(lái)降低蛋白的表達(dá)水平。
由于miRNA與靶mRNA之間的堿基配對(duì)不需要完全互補(bǔ)，因此它們可以識(shí)別并調(diào)節(jié)多個(gè)靶基因的表達(dá)，也就是說(shuō)一個(gè)miRNA可以對(duì)應(yīng)多個(gè)mRNA序列進(jìn)行干擾和調(diào)節(jié)。同時(shí)，miRNA作為內(nèi)源性RNA分子，在細(xì)胞內(nèi)的存在和作用更加復(fù)雜且微妙，它們可以通過(guò)與靶mRNA的結(jié)合來(lái)影響其穩(wěn)定性、翻譯效率以及與其他分子的相互作用等。
科學(xué)家在解析了miRNA的作用機(jī)制后開(kāi)始意識(shí)到，由于靶點(diǎn)眾多，miRNA的靶向性相對(duì)而言可能不夠精確，有時(shí)難以準(zhǔn)確而有效地阻斷特定基因的表達(dá)。這種靶向性的不足，在一定程度上限制了miRNA在基因調(diào)控領(lǐng)域的應(yīng)用范圍和效率。
因此科學(xué)家們發(fā)明了siRNA（小干擾RNA）這一人造的RNA干擾工具。siRNA是一種長(zhǎng)度為21-23個(gè)核苷酸的雙鏈RNA分子。它們通常通過(guò)化學(xué)合成或體外轉(zhuǎn)錄等方法獲得，并可以與特定的靶mRNA序列完全互補(bǔ)配對(duì)。其作用機(jī)制與miRNA相似：當(dāng)雙鏈siRNA進(jìn)入細(xì)胞后，它們會(huì)被RISC復(fù)合體識(shí)別并切割成單鏈形式。然后，單鏈siRNA會(huì)與靶mRNA結(jié)合并引導(dǎo)RISC復(fù)合體對(duì)其進(jìn)行切割或降解。與miRNA不同的是，siRNA是非內(nèi)源性的RNA分子而是人為設(shè)計(jì)合成的，我們可以對(duì)其序列、結(jié)構(gòu)和活性可以進(jìn)行精確的控制和調(diào)整，因此siRNA通常比miRNA具有更強(qiáng)的精準(zhǔn)性和靶向性。
siRNA一般有兩種靶向序列：一種是CDS序列（編碼序列），另一種是調(diào)控區(qū)（即非編碼區(qū)，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)錄因子等所在的區(qū)域）。由于CDS序列與蛋白質(zhì)的氨基酸序列直接相關(guān)，因此針對(duì)CDS設(shè)計(jì)的siRNA能夠高度特異性地識(shí)別并降解目標(biāo)mRNA，從而顯著抑制靶基因的表達(dá)。而靶向調(diào)控區(qū)的siRNA設(shè)計(jì)的基因干擾過(guò)程通常涉及DNA的甲基化，因此會(huì)導(dǎo)致基因沉默而非降解mRNA。同時(shí)由于調(diào)控區(qū)的序列復(fù)雜性較高，且不同基因之間的調(diào)控機(jī)制存在差異，靶向調(diào)控區(qū)的siRNA可能通過(guò)影響基因表達(dá)的調(diào)控過(guò)程來(lái)間接調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平，但其作用機(jī)制和效果可能相對(duì)復(fù)雜和難以預(yù)測(cè)。因此在我們?cè)O(shè)計(jì)siRNA時(shí)可盡量選擇CDS區(qū)來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)以提高其干擾效果。
然而，siRNA的發(fā)展也面臨著一些挑戰(zhàn)。由于siRNA是非內(nèi)源性的RNA分子，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性和持久性相對(duì)較差。同時(shí)，siRNA的轉(zhuǎn)染效率和靶向性也受到多種因素的影響，如細(xì)胞類型、轉(zhuǎn)染方法、siRNA序列設(shè)計(jì)等。這些因素限制了siRNA在基因治療等領(lǐng)域的應(yīng)用。
為了克服這些挑戰(zhàn)，科學(xué)家們在siRNA的基礎(chǔ)上發(fā)明了shRNA。shRNA是一種具有特殊結(jié)構(gòu)的RNA分子，它們可以形成一個(gè)短發(fā)夾結(jié)構(gòu)并包含兩個(gè)互補(bǔ)的序列，且通過(guò)載體病毒等介質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞。當(dāng)shRNA進(jìn)入細(xì)胞后，它們會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的酶識(shí)別并切割成兩個(gè)單鏈形式的siRNA分子。然后，這兩個(gè)siRNA分子會(huì)分別靶向并降解不同的靶mRNA序列。
shRNA的出現(xiàn)解決了siRNA瞬時(shí)效應(yīng)的問(wèn)題。由于shRNA可以在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生siRNA分子，因此它們可以實(shí)現(xiàn)持續(xù)穩(wěn)定的基因干擾效果。這種特性使得shRNA在基因治療、疾病模型構(gòu)建等領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用前景。
此外，還有一個(gè)有趣的問(wèn)題值得探討：能否用RNA干擾技術(shù)干擾掉RNA干擾現(xiàn)象呢？這個(gè)問(wèn)題看起來(lái)似乎有些抽象和自相矛盾，但其實(shí)目前市面上售賣的許多miRNA的抑制劑可以不就可以完美解決這個(gè)問(wèn)題嗎？這些抑制劑通過(guò)與miRNA結(jié)合來(lái)阻止其與靶mRNA的配對(duì)和切割過(guò)程，從而抑制RNA干擾現(xiàn)象。同樣地，我們也可以設(shè)計(jì)針對(duì)siRNA或shRNA的抑制劑來(lái)干擾它們的作用效果。這種策略為RNA干擾技術(shù)的調(diào)控和應(yīng)用提供了新的思路和方法。
在了解了RNA干擾技術(shù)的起源、發(fā)展歷程以及miRNA、siRNA和shRNA的具體作用機(jī)制后，接下來(lái)我們對(duì)這三類小分子RNA進(jìn)行一個(gè)總結(jié)，分析下他們的異同。
1. 差異：
① 來(lái)源與性質(zhì)：miRNA是內(nèi)源性的RNA分子，而siRNA和shRNA則是人造的非內(nèi)源性RNA分子。
② 持久性與穩(wěn)定性：由于miRNA是內(nèi)源性的，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的存在和作用更加穩(wěn)定且持久；而siRNA則存在瞬時(shí)效應(yīng)的問(wèn)題，需要頻繁轉(zhuǎn)染才能維持干擾效果（這也是為什么通常我們會(huì)發(fā)現(xiàn)siRNA在轉(zhuǎn)染后72-96h干擾效果非常不好的原因）；shRNA則通過(guò)持續(xù)產(chǎn)生siRNA分子來(lái)解決這一問(wèn)題。
③ 靶向性：siRNA和shRNA具有更強(qiáng)的精準(zhǔn)性和靶向性，可以針對(duì)特定的靶mRNA序列進(jìn)行干擾，一對(duì)一；而miRNA的靶點(diǎn)通常非常多，一個(gè)miRNA可以對(duì)應(yīng)多個(gè)mRNA序列進(jìn)行干擾和調(diào)節(jié)，一對(duì)多。
2. 相似之處：
① 作用效果：無(wú)論是miRNA、siRNA還是shRNA，它們都屬于基因沉默的范疇。它們都是通過(guò)特定的RNA分子與靶mRNA序列進(jìn)行配對(duì)和切割來(lái)實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的抑制或調(diào)節(jié)。
② 原理與結(jié)構(gòu)：這三類RNA都遵循著相似的原理和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。它們都通過(guò)堿基配對(duì)來(lái)識(shí)別并切割靶RNA分子；同時(shí)，它們都具有特定的序列和結(jié)構(gòu)特征來(lái)確保其功能的實(shí)現(xiàn)。
總的來(lái)說(shuō)，RNA干擾技術(shù)作為技能功能研究領(lǐng)域的一項(xiàng)革命性突破，為我們提供了強(qiáng)大的工具和方法來(lái)研究和調(diào)控基因表達(dá)。通過(guò)深入了解miRNA、siRNA和shRNA等RNA分子的作用機(jī)制和特點(diǎn)，我們可以更好地利用這些工具來(lái)探索生命的奧秘并為疾病治療、基因編輯等領(lǐng)域帶來(lái)新的希望和突破。本期內(nèi)容就講到這里，想看視頻版本的可以直接點(diǎn)擊【RNA干擾：你真的了解它的奧妙嗎？】
希望能對(duì)大家有所啟示！謝謝大家。
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