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一、甲苯胺藍（TB）染色簡介

甲苯胺藍是常用的人工合成染料的一種，屬醌亞胺染料類。含有兩個發(fā)色團和助色團使切片上的組織細胞著色，臨床上常用甲苯胺藍對軟骨細胞和肥大細胞進行染色。

二、甲苯胺藍染色詳細實驗步驟

  Step1：樣本烘干：將取材后貯備進行甲苯胺藍染色的樣本放入烤箱中65攝氏度烘片30分鐘，將樣本風干后方便后續(xù)的操作。 
   Step2：樣本脫蠟：將風干的樣本放在染色架上，依次放入二甲苯I、二甲苯II溶液浸泡脫蠟各五分鐘。目的是將樣本中的石蠟溶解掉，蠟不溶于水，如果脫蠟不干凈就會引起甲苯胺藍染色物不均勻、陽性物時隱時現(xiàn)、背景染色增加等問題。所以脫蠟的時間要根據(jù)季節(jié)、溫度和試劑的新鮮程度調(diào)整，如果溫度較高脫蠟劑新鮮則脫蠟時間不需要太多，3-5分鐘就足夠，如果溫度較低脫蠟劑陳舊則適當延長浸泡的時間。

  Step3：樣本水化：將已經(jīng)浸泡脫蠟的組織樣本先放入無水乙醇I中浸泡兩分鐘，洗出脫蠟劑時樣本中殘留的二甲苯使水可以進入組織，然后再將樣本置于95%、85%、75%、自來水各兩分鐘以達到充分水化的效果。

 Step4：樣本染色：將水化好的樣本切片用移液槍吸取甲苯胺藍染色液滴加或者浸染5-30分鐘，染色過程可在鏡下控制，具體時間根據(jù)染色液濃度和室溫等因素進行調(diào)整；染色后用流水充分清洗兩分鐘，再滴加1%的鹽酸酒精進行分化，使細胞核中結(jié)合過多的染色液和細胞漿中多余的染色液被除去，直至細胞呈紫藍色清晰可見；分化完成后用流水沖洗5分鐘，蒸餾水沖洗1-2秒，將沖洗好的切片放入烘箱中徹底干燥。

  Step5：樣本脫水：將染色干燥完畢后的樣本進行脫水，分別將樣本浸入無水乙醇I 30秒、無水乙醇II 1分鐘。置換出染色過程中樣本吸收的水分，浸泡時間因為組織大小、厚薄不同而適當調(diào)整，水脫不干凈，透明劑就無法完全置換，影響切片質(zhì)量。
   Step6：樣本透明：將脫完水的甲苯胺藍染色切片浸入二甲苯2分鐘。組織在無水乙醇內(nèi)完全脫水后透明劑(二甲苯）能把脫水劑置換出來，組織全部為透明劑填充，在光線下呈半透明狀，方便后續(xù)的鏡下觀察和封片保存。

   Step7：樣本封片: 在透明處理完畢后的組織上方滴加中性樹膠，玻片稍傾斜，用手將蓋片順玻片斜面輕放，防止氣泡產(chǎn)生。封片前需要烤干切片上的水分，否則鏡下觀察時有一層水霧，導致細胞輪廓不清楚。封片時只需用一次性滴管滴一兩滴即可，過少導致封片不完全，過多則容易中性樹膠外溢影響保存。

   Step8：鏡下檢查:顯微鏡下觀察拍照并記錄。

  甲苯胺藍染色實驗步驟視頻點此跳轉(zhuǎn)（微信荔枝微課）

三、甲苯胺藍染色的常見問題與注意事項

1、常見問題

1）染色時間過長或過短導致的染色過深或過淺。

2）植物組織較脆，易出現(xiàn)掉片。

2、注意事項

   1）控制染色時間，保證染色不至于過深或過淺，必要時可在顯微鏡下觀察控制染色時間。

  2）水洗時間不宜過長，保證陽性顯色清晰可見。

 3）植物組織切片時應(yīng)控制切片厚度以及攤片時間，減少掉片風險。