EdU檢測實驗操作步驟——及熒光定量分析數(shù)據(jù)
2023-08-09 10:04:48
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺
一、實驗?zāi)康?/span>
EdU檢測不同轉(zhuǎn)染處理對細(xì)胞增殖能力的影響。
二、實驗樣品
2.1 實驗樣本
備注：包括干預(yù)細(xì)胞用的相關(guān)試劑均按實驗樣品登記，每行登記一個或一組獨立樣品。
2.2 實驗參數(shù)
三、實驗結(jié)果
圖1：EdU熒光檢測示例圖
圖2：熒光定量分析柱狀圖
四、實驗結(jié)論
如圖所示，在CAL27細(xì)胞中，mimics NC和miR-23b-3p mimics組間無明顯差異，與inhibitorNC組相比，miR-23b-3p inhibitor組細(xì)胞增殖能力有所上調(diào)；SCC25細(xì)胞各組間無明顯差異。
請注意：因無法獲知研究背景及研究方案，我司提交的結(jié)果說明僅針對該次檢測結(jié)果進(jìn)行客觀描述，所下結(jié)論僅供參考。請合理判斷該檢測結(jié)果的可用性。
五、實驗步驟
3.1 細(xì)胞復(fù)蘇 （如有）
(1)將ddH2O預(yù)溫至37℃。
(2)戴上手套和口罩帽子，從液氮罐中取出裝有目的細(xì)胞的凍存管（內(nèi)有1 mL細(xì)胞混合液），立即投入37℃ ddH2O中，輕搖凍存管使之在1分鐘內(nèi)快速溶解。
(3)完全溶解后，75%酒精擦拭凍存管外壁消毒后帶進(jìn)超凈臺。
(4)在超凈臺中，在15 mL滅菌離心管中預(yù)先加入10 mL新鮮配制的培養(yǎng)基，打開凍存管，將所有凍融的細(xì)胞懸液加入該離心管中，常溫1000 rpm離心3分鐘，吸除上層的培養(yǎng)液。
(5)1 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，輕輕吹打混勻后加入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補足培養(yǎng)基至5 mL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
(6)48小時后換液，細(xì)胞融合接近80%時即可傳代。
3.2 細(xì)胞鋪板及轉(zhuǎn)染 （如有）
取處于對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞用0.25%胰酶消化后，通過細(xì)胞計數(shù)計算后，按照密度為4×104個細(xì)胞/孔，種到24孔板中，鋪細(xì)胞18-24 h (盡量不要超過24小時，否則影響轉(zhuǎn)染效率)，細(xì)胞長至70～90%轉(zhuǎn)染（細(xì)胞密度過稀或者過密均會影響轉(zhuǎn)染效率），以24孔板為例：
(1) 將 1.6 μL LipoFiter /2 μL Lipo2000加入50 μLopti-mem Medium中,變成預(yù)混液1，室溫放置5 min。
(2) 將0.8 μg質(zhì)粒/20 pmol目的片段加入到50 μL opti-mem Medium中混合，變成預(yù)混液2。
(3) 將質(zhì)粒和 LipoFiter/Lipo2000混合（預(yù)混液1和預(yù)混液2進(jìn)行混合），室溫放置20分鐘。
(4) 將24孔板里的完全培養(yǎng)基換成150 μL opti-mem Medium。
(5) 將轉(zhuǎn)染混合液緩慢加入到24孔板，輕輕前后晃動混勻。
(6) 37℃，5% CO2培養(yǎng)6 h后將培養(yǎng)基換成完全培養(yǎng)基。
3.3 EdU檢測實驗步驟
EdU 標(biāo)記：
（1）用細(xì)胞完全培養(yǎng)基按比例稀釋EdU溶液，制備適量2×EdU 工作液，終濃度為50μM；
（2）每孔加入37°水浴的 EdU 工作液液500μL和500μL培養(yǎng)基（1比1），混合均勻后于培養(yǎng)箱孵育6-7小時（可根據(jù)細(xì)胞增殖速度，適當(dāng)調(diào)整孵育時間），使EdU終濃度為50 μM ；
（3）棄孵育培養(yǎng)基，PBS（含3%BSA，以下PBS表示）清洗細(xì)胞3次，每次5分鐘。
細(xì)胞固定及通透：
（1）每孔加入1 mL細(xì)胞固定液 (即含4%多聚甲醛的 PBS)室溫孵育15分鐘，棄固定液；
（2）每孔加入PBS，清洗3次，每次5分鐘；
（3）每孔加入1 mL滲透劑(0.3% TritonX-100的PBS)室溫孵育15分鐘；PBS清洗3次，每次5分鐘
EdU檢測：
（1）每孔加入0.2 ml Click反應(yīng)混合液，輕輕搖晃培養(yǎng)板以確保反應(yīng)混合物可以均勻覆蓋樣品，體系按需配置；避光反應(yīng)1-2小時；
（2）吸除Click反應(yīng)液，用洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘；
DNA 染色：
（1） DAPI溶液的配制：按1:1000比例用PBS稀釋DAPI (1000X），避光保存；
（2） 每孔加1X DAPI溶液1ml，室溫避光孵育10分鐘左右；
（3）每孔加入PBS 清洗 1~3 次；
（4）采圖。
五、熒光定量分析數(shù)據(jù)
注：組化定量分析采用image pro plus 6.0軟件，IOD值為圖片上各點光密度值的累加，此值與目標(biāo)物質(zhì)的總量成正比；IOD值除以目標(biāo)分布區(qū)域的面積，得到平均density,此值反映了目標(biāo)物質(zhì)的單位面積濃度。對樣品照片進(jìn)行數(shù)字圖像分析比較時，就是比較他們之間的平均光密度值的大小。
單位為a.u.(arbitrary unit)，是無量綱單位
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