Western blot檢測實驗常見問題原因及解決方法（上）
2022-03-01 15:22:46
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺
Western blot（蛋白質(zhì)免疫印跡）實驗操作的常見問題原因與解決辦法由普拉特澤生物旗下生物科研培訓(xùn)品牌《春風(fēng)學(xué)院》對數(shù)千例WB檢測實驗分析后總結(jié)分享，分為上、中、下三個部分為大家詳細講解，文章末更有Western Blot實驗理論+實操視頻課程參考學(xué)習(xí)。普拉特澤生物提供線下WB檢測培訓(xùn)及各類生物實驗外包服務(wù)，是您生物科研路上的好盟友哦！
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常見問題 ：一、Western blot實驗結(jié)果中背景較高
原因1： 膜封閉不夠，封閉不充分或封閉液不合適；
解決方法：WB檢測前選擇更加合適的封閉液，并適當(dāng)延長優(yōu)化封閉條件時間與溫度。
原因2：一抗稀度不合適、孵育溫度過高；
解決方法：對抗體進行滴度測試，選擇最合適的抗體稀釋度，可以4℃結(jié)合過夜。
原因3：抗體孵育濃度過高，孵育時間過長
解決方法：優(yōu)化或適當(dāng)降低減少抗體孵育濃度與時間。
原因4：洗滌不充分；
解決方法：洗滌次數(shù)和時間適當(dāng)延長。
原因5：二抗非特異性結(jié)合；
解決方法： 設(shè)置二抗對照，并選擇合適的二抗試劑。
原因6：膜在實驗過程中干過（干膜）；
解決方法：整個實驗操作過程中保持膜濕潤狀態(tài).
原因7：蛋白質(zhì)免疫印跡轉(zhuǎn)膜過程中膜污染；
解決方法：操作過程保持膜整潔，不要用手按壓膜的任何部位，不要讓膜接觸帶其他不干凈的器材。
原因8：發(fā)光底物過度殘留；
解決方法：吸干多余發(fā)光液后進行顯影。
原因9：顯影時間過長；
解決方法：壓膠片的時間要長短適中，減少曝光時間，在顯影液中不要停留太長或太短時間。
常見問題 ：二、Western blot實驗結(jié)果中無目的條帶
原因1：樣本中所含目的蛋白表達量過低或無表達；
解決方法：首先確認WB實驗前期制備的蛋白樣本可行性，對表達過低的樣本進行富集后再進行實驗；更換超敏ECL并適當(dāng)延長曝光時間。
原因2：Western Blot蛋白提取時降解；
解決方法：蛋白提取時，保持低溫狀態(tài)，并加入相應(yīng)的蛋白酶抑制劑。
原因3：蛋白樣本保存條件不合適，蛋白降解；
解決方法：蛋白樣本加入上樣緩沖液煮沸變性后保存，對于稀有樣本建議分裝于-80℃保存，避免反復(fù)凍融，盡快完成檢測。
原因4：蛋白轉(zhuǎn)膜效率低；
解決方法：麗春紅染色確認轉(zhuǎn)膜體系是否正常。
原因5：一抗二抗檢測體系不匹配；
解決方法：WB檢測前選擇合適的一抗二抗。
原因6：抗體失活；
解決方法：正確保存抗體。
原因7：顯影液使用時間過長；
解決方法：使用新鮮試劑，并避光保存。
好啦，Western blot實驗常見問題原因以及解決方法上篇就先介紹到這里啦，欲知后事如何，且聽下回分解！是不是很詳細全面呢？想要詳細學(xué)習(xí)實驗操作方法的好學(xué)者們可點擊《Western Blot實驗理論+實操》觀看學(xué)習(xí)哦！
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